肺腺癌惡性胸腔積液EGFR突變檢測(cè)及其臨床意義*

陳軒 李真斌 鄒斌 易向軍

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，臨床確診病例70%已為晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，盡管不斷有新的化療藥物問世，但仍然未突破化療的瓶頸，患者的預(yù)后仍較差，5年生存率不足20%。伴隨著分子靶向藥物的成功研發(fā)，諸如進(jìn)口的吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Eriotinib）及我國自主生產(chǎn)的?？颂婺幔╝iketinib）相繼被批準(zhǔn)上市用于治療晚期肺癌。靶向治療是目前腫瘤治療的新策略之一，也給肺癌患者帶來了巨大的希望。2004年，Lynch等[1]和Paez等[2]最先報(bào)道肺癌組織中EGFR酪氨酸激酶編碼區(qū)基因突變是靶向藥物治療有效的一個(gè)重要因素。研究證明EGFR基因突變狀態(tài)與靶向藥物的臨床療效密切相關(guān)，且EGFR敏感突變陽性者對(duì)EGFR-TKI療效好[3-4]。因此，通過EGFR基因診斷可以篩選出合適的患者進(jìn)行有針對(duì)性的靶向治療，從而顯著提高藥物療效。但是肺癌在確診時(shí)超過70%患者已為Ⅲ、Ⅳ期，腫瘤組織難以獲取。鑒于此，能否利用腫瘤患者惡性胸腔積液DNA進(jìn)行晚期肺腺癌腫瘤細(xì)胞基因突變檢測(cè)[5-6]，從而用于EGFR-TKI靶向藥物療效預(yù)測(cè)將成為研究熱點(diǎn)。筆者于2015-2017年采用ARMS法檢測(cè)肺腺癌患者惡性胸腔積液EGFR突變狀態(tài)，突變者給予EGFR-TKI治療，取得較好效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月-2017年10月江西省胸科醫(yī)院收治的50例肺腺癌患者的惡性胸腔積液樣本50例，其中男23例，女27例，年齡46～80歲，平均年齡63歲。胸腔積液均中找到腺癌細(xì)胞。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)胸腔積液細(xì)胞學(xué)診斷為肺腺癌；②均接受EGFR基因檢測(cè)；③臨床分期為Ⅳ期；④30～70歲，PS 0～2分；⑤無重要臟器功能不全；⑥有至少一個(gè)可測(cè)量的病灶。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：有嚴(yán)重心腦血管疾病、肝腎功能障礙、肺部感染、既往接受過化療、合并其他部位原發(fā)瘤。該研究已經(jīng)論理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 方法 采用Qiagen 51304 QIAamp DNA Mini Kit人類DNA提取試劑盒提取標(biāo)本胸腔積液DNA，然后使用AmoyDx EGFR ADx-EG0X基因突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)EGFR基因的突變情況。胸腔積液有EGFR基因突變的患者口服吉非替尼（生產(chǎn)廠家：AstraZeneca UK Limited，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字J20070047）250 mg/次，每日一次；或厄洛替尼（生產(chǎn)廠家：上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字J20070031）150 mg/次，每日一次；或埃克替尼（生產(chǎn)廠家：貝達(dá)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20110061）125 mg/次，每日三次，直到病情進(jìn)展或者因不良反應(yīng)不能耐受，患者用藥時(shí)均停用全身化療1個(gè)月。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 入組患者于服藥前及服藥后每4周復(fù)查胸CT及轉(zhuǎn)移病灶CT檢查。按照實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，療效分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）和進(jìn)展（PD）?？陀^緩解（ORR）=CR+PR，疾病控制（DCR）=CR+PR+SD。無進(jìn)展生存期（PFS）是指患者從首次用藥至觀察到疾病進(jìn)展或因任何原因死亡的時(shí)間間隔（以發(fā)生在先的事件計(jì)算），在數(shù)據(jù)截止時(shí)尚未進(jìn)展或死亡的患者，及研究中失訪的患者將以其最后1次腫瘤評(píng)價(jià)的時(shí)期計(jì)算?？偵嫫冢∣S）指患者首次用藥到由于任何原因死亡，在數(shù)據(jù)截止日尚生存的患者或在研究中失訪的患者將以其最后1次聯(lián)絡(luò)的日期作為截尾數(shù)值進(jìn)行分析。

1.4 隨訪 采用電話方式隨訪，36例患者均有隨訪資料，末次隨訪時(shí)間2018年6月30日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，使用乘積極限法又稱Kaplan-Meier法及Logrank法比較生存時(shí)間及生存率，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 惡性胸腔積液EGFR基因突變的檢出結(jié)果 在50例肺腺癌患者惡性胸腔積液中檢測(cè)到EGFR基因突變36例，突變檢出率為72.0%，在這些突變的樣本中，外顯子19和21突變分別占80.5%（29/36）和 19.5%（7/36）。

2.2 EGFR基因突變與患者臨床特點(diǎn)之間的關(guān)系 36例EGFR基因突變患者中，1例患者服藥1周后癥狀緩解，5例患者服藥2周后癥狀緩解，26例患者服藥1個(gè)月后癥狀緩解，4例患者無效，臨床有效率88.9%（32/36）?？诜邢蛩幬?個(gè)月后復(fù)查CT肺部及轉(zhuǎn)移灶療效評(píng)價(jià)，CR 0例，PR 24例，SD8例，PD 4例，客觀緩解率為66.7%，疾病控制率為88.9%。整組中位無進(jìn)展生存期（PFS）為10.0個(gè)月（8.6～11.3個(gè)月），EGFR 19外顯子突變和21外顯子突變患者的中位PFS分別為10.0、9.0個(gè)月，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=1.548，P=0.213），見圖1、2。整組總生存期（OS）為26個(gè)月（23.4～28.5個(gè)月），1年生存率57.1%，2年生存率21.4%。EGFR19外顯子突變和21外顯子突變患者的中位OS分別為28.0、21.0個(gè)月，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=7.585，P=0.006），見圖 3、4。

圖1 36例EGFR19外顯子和21外顯子突變患者無進(jìn)展生存時(shí)間曲線

圖2 36例EGFR突變患者無進(jìn)展生存時(shí)間曲線

圖3 36例EGFR19外顯子和21外顯子突變患者總生存時(shí)間曲線

圖4 36例EGFR突變患者總生存時(shí)間曲線

2.3 靶向治療的不良反應(yīng) 對(duì)36例胸腔積液EGFR基因突變患者治療中出現(xiàn)的不良反應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，皮疹最為常見44.4%（16/36），其次為腹瀉27.8%（10/36），其他少見的不良反應(yīng)包括：消化道黏膜炎 11.1%（4/36），食欲減退 8.3%（3/36），乏力5.6%（2/36），咳嗽 2.8%（1/36）等，多數(shù)為Ⅰ～Ⅱ度86.1%（31/36），極少數(shù)可見Ⅲ度13.9%（5/36），未見Ⅳ度不良反應(yīng)。見表1。

表1 靶向治療的不良反應(yīng) 例

3 討論

非小細(xì)胞肺癌靶向治療的療效與EGFR的突變狀態(tài)密切相關(guān)，而且突變基因不同的治療效果也不盡相同[7-9]。因此明確EGFR基因是否突變及突變類型對(duì)指導(dǎo)靶向治療有很大的幫助。晚期肺癌患者的診斷主要依據(jù)病理活檢和影像學(xué)檢查，但晚期肺癌患者已無手術(shù)適應(yīng)證，難以獲取病理組織。盡管可通過經(jīng)皮肺穿刺術(shù)、支氣管鏡等方法獲取到組織，但有時(shí)癌組織少，難以用于病理免疫組化及基因檢測(cè)。由此可見，盡快找到方便、快捷而又準(zhǔn)確的途徑來評(píng)價(jià)肺癌患者EGFR突變狀態(tài)顯得尤為關(guān)鍵。惡性胸水是晚期肺癌常見并發(fā)癥之一，而且胸腔閉式引流術(shù)或胸膜腔穿刺術(shù)是行之有效獲取胸腔積液的方法。國外研究報(bào)道胸腔積液中腫瘤細(xì)胞塊DNA可以檢測(cè)到一些癌基因突變，與原發(fā)腫瘤組織的基因突變高度相符[6]。國內(nèi)也有文獻(xiàn)[10]報(bào)道在癌性胸水中提取腫瘤細(xì)胞DNA，能有效檢出EGFR突變，胸腔積液細(xì)胞塊與組織樣本在EGFR基因突變上具有較高的一致性。萬莉娟等[11]發(fā)現(xiàn)胸腔積液與腫瘤組織EGFR基因突變的符合率達(dá)到80%以上，這兩種標(biāo)本來源對(duì)EGFR檢測(cè)的突變比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

吉非替尼、厄洛替尼和?？颂婺峋歉咝?、選擇性的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，抑制肺癌細(xì)胞的游走、黏附、侵襲和血管新生，促使肺癌細(xì)胞凋亡。這三種EGFR-TKI類藥物均可用于EGFR突變敏感型的非小細(xì)胞肺癌的靶向治療，且療效和不良相好似[12]。國內(nèi)易涵等[13]研究顯示吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼三組藥物治療晚期非小細(xì)胞肺癌的客觀有效率分別為66.7%、70.0%和63.3%，比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；無進(jìn)展生存期分別為0.934、1.079和1.063年，生存曲線比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.001，P=0.999 0），不良反應(yīng)主要為皮疹、腹瀉。該研究結(jié)果與本研究結(jié)果相仿（客觀緩解率66.6%，中位無進(jìn)展生存期為10.0個(gè)月，中位總生存期為26個(gè)月），值得注意的是：本研究是采用惡性胸腔積液檢測(cè)EGFR基因突變狀態(tài)，雖然與易涵等[13]采用的組織標(biāo)本不同，但研究結(jié)果卻高度相似，而且本研究還發(fā)現(xiàn)EGFR19外顯子突變的患者比21外顯子突變患者在中位生存期上獲益更大，中位OS：28.0個(gè)月 vs 21.0個(gè)月，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=7.585，P=0.006）。文獻(xiàn)[14]得出更好的結(jié)果（中位PFS 14.3個(gè)月，中位OS 30.8個(gè)月）。EGFR-TKI治療EGFR突變敏感型的非小細(xì)胞肺癌患者，不僅療效確切，而且不良反應(yīng)多可為患者耐受，未見嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。在本研究中僅觀察到輕至中度的不良反應(yīng)，例如皮疹、腹瀉、黏膜炎等，與國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道結(jié)果相似。綜上分析初步認(rèn)為惡性胸腔積液可以作為肺腺癌患者進(jìn)行EGFR基因突變的檢測(cè)標(biāo)本，進(jìn)而可預(yù)測(cè)靶向治療的療效，但仍然需要大樣本的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)進(jìn)一步證實(shí)。

以前臨床上EGFR突變最常用的檢測(cè)方法是直接測(cè)序法，被稱為檢測(cè)基因突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，能明確目的片段中每一個(gè)堿基狀態(tài)，但也有不足之處，其測(cè)序圖譜有時(shí)令研究者很難做出準(zhǔn)確判斷。伴隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，諸如突變擴(kuò)增阻滯技術(shù)（ARMS法）等更先進(jìn)技術(shù)運(yùn)用于臨床基因測(cè)序。有研究證明，ARMS法操作簡單，突變檢出率高于直接測(cè)序法[17]。而且上海市肺科醫(yī)院的任睿欣等[18]研究顯示：ARMS法檢測(cè)NSCLC微小標(biāo)本（CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢標(biāo)本，支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)下針吸活檢標(biāo)本，淋巴結(jié)針吸活檢活檢標(biāo)本，支氣管鏡活檢標(biāo)本以及胸腔積液等）也能獲得較高的EGFR突變檢出率，對(duì)于晚期肺癌難以取得大標(biāo)本的患者，微小標(biāo)本可代替大標(biāo)本用于臨床EGFR突變檢測(cè)，豐富了晚期肺癌患者基因檢測(cè)的取材途徑及方法。本研究采用ARMS法對(duì)50例肺腺癌惡性胸腔積液進(jìn)行了EGFR基因突變檢測(cè)，突變者36例，突變檢出率為72.0%，更好地指導(dǎo)了臨床靶向用藥，減輕了患者的痛苦，取得了較好的療效?，F(xiàn)今二代基因測(cè)序技術(shù)高通量測(cè)序技術(shù)（NGS法）已經(jīng)逐漸運(yùn)用于臨床，具有更高效的靈敏度，使得可以抽取靜脈血用于檢測(cè)基因突變，且檢測(cè)率與運(yùn)用胸腔積液的檢出率相當(dāng)[19]，文獻(xiàn)[20]顯示外周血與病理組織切片EGFR基因檢測(cè)結(jié)果一致性較好，使得外周血基因檢測(cè)有可能成為臨床無法取得病理組織標(biāo)本患者的替代選擇，方便了基因檢測(cè)的取材，更好地造福了患者。