白術(shù)芍藥散聯(lián)合美沙拉嗪治療潰瘍性結(jié)腸炎臨床療效及對血清和結(jié)腸黏膜NGAL、MMP-9 表達水平的影響

楊倩倩 周建波 蔡 升 方 瑩

作者單位：寧波大學(xué)附屬陽明醫(yī)院消化內(nèi)科（余姚315400）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種自直腸向結(jié)腸逆行蔓延的慢性非特異性炎癥，病程遷延難愈，病情反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[1]。目前UC 尚無特效治療方案，其臨床常用藥物包括氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類及免疫抑制劑類，但上述藥物的療效差強人意，且具有一定的副作用[2]。白術(shù)芍藥散又稱痛瀉要方，源自《丹溪心法》，組方由白術(shù)、白芍、陳皮和防風(fēng)構(gòu)成，具有柔肝止痛、補脾止瀉的效果，在治療腸鳴腹痛、大便泄瀉和肝旺脾虛諸證中療效可靠。研究顯示，白術(shù)芍藥散治療UC 具有良好的療效及安全性[3-4]。中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）是脂質(zhì)運載蛋白家族的一個成員，表達于人體的結(jié)腸、胃、肝等多個組織，參與機體的炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細胞凋亡、細胞分化等多種生理病理過程[5]。本研究檢測UC 患者血清及結(jié)腸黏膜NGAL、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）mRNA 表達水平，探討白術(shù)芍藥散治療UC 的可能作用機制。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2015 年6 月-2016 年6 月在寧波大學(xué)附屬陽明醫(yī)院消化內(nèi)科診治初發(fā)型潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者80 例，采用隨機數(shù)字表法分為觀察組和對照組，各40 例。觀察組中男24 例，女16 例，平均年齡（42.18±9.25）歲，平均病程（5.26±3.48）年；對照組中男25 例，女15 例，平均年齡（41.87±9.23）歲，平均病程（5.22±3.45）年。本研究方案通過醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，患者知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者符合中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病學(xué)組“炎癥性腸病診斷與治療的共識意見”[6]中有關(guān)輕、中型UC的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）患者或家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）重型UC；（2）合并腦、肺、心、肝、腎等臟器的嚴(yán)重疾病；（3）哺乳及妊娠期婦女；（4）藥物過敏者。

2 方 法

2.1 治療方法 對照組給予美沙拉嗪腸溶片（規(guī)格：0.25g/片，批號150320，葵花藥業(yè)）1.0g，1 天4 次，觀察組在對照組基礎(chǔ)上給予白術(shù)芍藥散煎劑（白術(shù)30g，白芍20g，陳皮15g，防風(fēng)20g，水煎2 次，取汁200mL）100mL，1 天2 次。兩組療程均為8 周。

2.2 觀察指標(biāo) 兩組患者治療結(jié)束后復(fù)查腸鏡并Mayo 評分量表[7]評估臨床療效。Mayo 評分量表：（1）排便次數(shù)：正常計0 分，每天增加1～2 次計1 分，每天增加3～4 次計2 分，每天增加＞5 次計3 分；（2）大便帶血：無大便帶血計0 分，大便帶血少于一半時間計1 分，大便帶血占大部分時間計2 分，大便帶血為持續(xù)性計3 分；（3）腸鏡檢查：無病變計0 分，有輕度病變（少許充血）計1 分，有中度病變（明顯糜爛）計2分，有重度病變（潰瘍形成）計3 分；（4）醫(yī)師評估病情：無異常計0 分，輕度計1 分，中度計2 分，重度計3 分。上述各項評分之和≤2 分則臨床緩解；3～5 分則輕度活動；6～10 分則中度活動；11～12 分則重度活動。分別于治療前后經(jīng)內(nèi)鏡取腸黏膜標(biāo)本，于-70℃凍存待檢。采用RT-PCR 檢測腸黏膜NGAL、MMP-9 mRNA 表達水平。取適量腸黏膜作成組織勻漿，以Trizol 法提取組織總RNA，再把獲得的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA 作為模板，分別添加目標(biāo)基因引物，上PCR 儀進行擴增。最后，取PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，并用溴化乙錠染色，之后圖像分析儀行半定量分析。分別于治療前后清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，經(jīng)外周靜脈抽取3mL 血液，離心并分離血清，于-70℃凍存待檢。采用ELISA 法檢測血清NGAL、MMP-9 蛋白表達水平。實驗過程嚴(yán)格按照說明書步驟進行操作。NGAL、MMP-9 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購于美國R&D公司、NGAL、MMP-9、β-actin 引物及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa 公司、總RNA 抽提試劑盒購于美國Invitrogen 公司、熒光定量PCR 儀購于美國Bio-Rad 公司。

2.3 療效標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)《對炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的建議》及Mayo 評分量表[7]評價臨床療效，顯效：臨床癥狀全部緩解，且大便次數(shù)≤2 次/天，大便鏡檢無白細胞、紅細胞。有效：臨床癥狀基本緩解，且大便次數(shù)2～4 次/天，大便鏡檢白細胞或紅細胞＜10 個/高倍鏡視野。無效：臨床癥狀、大便次數(shù)、大便鏡檢細胞數(shù)都未緩解。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料用%表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 兩組UC 患者基礎(chǔ)資料比較 兩組UC 患者性別、年齡、病程等資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

3.2 兩組UA 患者治療后臨床癥狀改善比較 治療后，觀察組40 例中顯效25 例，有效12 例，無效3例，總有效率92.5%；對照組40 例，顯效18 例，有效10 例，無效12 例，總有效率70%，觀察組總有效率顯著優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3.3 兩組UA 患者Mayo 評分比較 治療后，兩組患者Mayo 評分均較治療前降低（P＜0.05），觀察組Mayo評分明顯低于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組潰瘍性結(jié)腸炎患者治療前后Mayo 評分比較（分）

表1 兩組潰瘍性結(jié)腸炎患者治療前后Mayo 評分比較（分）

注：與本組治療前比較，△P＜0.05；與對照組治療后比較，*P＜0.05；對照組給予美沙拉嗪腸溶片治療；觀察組給予美沙拉嗪腸溶片+白術(shù)芍藥散

組別 例數(shù) 治療前 治療后對照組406.58±3.462.24±1.15△觀察組406.61±3.521.32±1.01*△

3.4 兩組UA 患者腸黏膜NGAL、MMP-9 mRNA 表達水平比較 兩組治療前腸黏膜NGAL、MMP-9 mRNA 表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，兩組患者腸黏膜NGAL、MMP-9 mRNA 水平均明顯降低（P＜0.05），觀察組腸黏膜NGAL、MMP-9 mRNA 表達水平較對照組降低明顯（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜NGAL、MMP-9 mRNA表達水平比較（）

表2 兩組潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜NGAL、MMP-9 mRNA表達水平比較（）

注：與本組治療前比較，△P＜0.05；與對照組治療后比較，*P＜0.05；NGAL：中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶9；對照組給予美沙拉嗪腸溶片治療；觀察組給予美沙拉嗪腸溶片+白術(shù)芍藥散

組別 例數(shù) 治療前NGA治L療 后 治療前MMP-治9療后對照組400.86±0.140.63±0.12△0.72±0.130.55±0.11△觀察組400.87±0.150.44±0.09*△0.73±0.140.39±0.09*△

3.5 兩組UA 患者血清NGAL、MMP-9 蛋白水平比較 兩組治療前血清NGAL、MMP-9 mRNA 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，兩組患者血清NGAL、MMP-9 mRNA 水平均明顯降低（P＜0.05），觀察組血清NGAL、MMP-9 蛋白水平較對照組降低明顯。見表3。

3.6 不良反應(yīng) 對照組發(fā)生惡心2 例，觀察組發(fā)生惡心1 例，均自行緩解。兩組間不良反應(yīng)發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 兩組潰瘍性結(jié)腸炎患者血清NGAL、MMP-9 水平比較（）

表3 兩組潰瘍性結(jié)腸炎患者血清NGAL、MMP-9 水平比較（）

注：與本組治療前比較，△P＜0.05；與對照組治療后比較，*P＜0.05；NGAL：中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶9；對照組給予美沙拉嗪腸溶片治療；觀察組給予美沙拉嗪腸溶片+白術(shù)芍藥散

組別 例數(shù) 治療N前G AL（ng/治mL療）后 治療MM前P-9（治pg療/m后L）對照組40137.06±30.18103.21±26.29△19.28±6.2612.48±4.25△觀察組40137.45±30.2479.25±18.54*△19.33±6.297.33±3.24*△

4 討 論

UC 發(fā)病機制尚未完全闡明，其涉及環(huán)境、遺傳、炎癥、免疫和腸道菌群等多種因素[8]。UC 屬中醫(yī)“五更泄”、“泄瀉”、“便血”等范疇，認為病因病機脾胃虛弱，脾失運化，濕熱瘀阻，腸絡(luò)受損[3]。白術(shù)芍藥散用白術(shù)苦甘而溫，補脾燥濕；白芍味酸性寒，柔肝止痛；陳皮辛苦而溫，醒脾和胃；防風(fēng)疏散肝郁，祛濕止瀉[9]。研究表明，白術(shù)含白術(shù)內(nèi)酯，而白術(shù)內(nèi)酯能抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細胞合成誘導(dǎo)型一氧化氮合酶及釋放TNF-α，繼而發(fā)揮抗炎效應(yīng)[10]。白芍總苷提取物能抑制前列腺素E2、白三烯B4 和一氧化氮的生成，而且能抑制淋巴細胞的增殖，還能調(diào)節(jié)輔助性T 細胞和抑制性T 細胞的分化[11]。陳皮含有黃酮類成分，能抑制LPS 誘導(dǎo)的NO，TNF-α，IL-1β 和IL-6 的產(chǎn)生[12]。防風(fēng)含香豆素類物質(zhì)，白芷靈（一種香豆素成分）能抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細胞中NFκB 信號通路激活[13]。本研究結(jié)果顯示，觀察組的臨床癥狀改善總有效率（86.00%）顯著優(yōu)于對照組（73.00%），提示白術(shù)芍藥散聯(lián)合美沙拉嗪治療UC 具有良好的臨床療效。

正常生理狀態(tài)下，NGAL 在腎、結(jié)腸、胃及肝臟等組織中表達水平極低；但當(dāng)炎癥發(fā)生時，NGAL 呈現(xiàn)出高表達[14]。研究顯示，NGAL 的持續(xù)升高與中性粒細胞的持續(xù)活化密切相關(guān)[15]。

研究顯示，NGAL 與TNF-α、IL-1β、CRP 等多種炎癥因子密切相關(guān)，NGAL 可能是炎癥反應(yīng)中的一個重要節(jié)點[16-17]。研究證實，MMP-9 通過降解基底膜中的Ⅳ型膠原，破壞腸黏膜屏障，使腸黏膜通透性升高，促進炎癥的擴散[18]。UC 患者血清NGAL、MMP-9 水平與UC 病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后，觀察組腸黏膜NGAL、MMP-9 mRNA 表達較對照組明顯降低；觀察組血清NGAL、MMP-9 蛋白表達較對照組明顯減少。上述結(jié)果提示，白術(shù)芍藥散可能通過抑制NGAL、MMP-9 的轉(zhuǎn)錄和表達，進而抑制腸道炎癥反應(yīng)，改善腸黏膜屏障。

綜上所述，白術(shù)芍藥散聯(lián)合美沙拉嗪治療UC 具有良好的臨床療效，其作用機制可能與抑制NGAL、MMP-9 的轉(zhuǎn)錄和表達，進而抑制腸道炎癥反應(yīng)，改善腸黏膜屏障有關(guān)。