高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定毛發(fā)中40種常見(jiàn)精神藥物

徐代化，歐 軍，陳深樹(shù)，徐期林，焦臺(tái)風(fēng)，程良紅，陳垚翰

(1.廣東南天司法鑒定所，廣東 深圳 518003; 2. 深圳黑爾格科技有限公司，廣東 深圳 518109)

近年來(lái)毛發(fā)中精神藥物的檢測(cè)領(lǐng)域引起了世界各國(guó)科學(xué)家越來(lái)越多的關(guān)注[1]. 毛發(fā)的檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于人類行為毒理學(xué)、犯罪刑偵與毒品成癮、藥物濫用與慢性中毒的診斷、死后毒理學(xué)、性犯罪、治療合規(guī)控制等領(lǐng)域[2].

高效高通量的毛發(fā)中精神藥物檢測(cè)技術(shù)的研究以及用藥頻度和用藥史與毛發(fā)中精神藥物含量的相關(guān)性研究近年來(lái)研究較為關(guān)注. 數(shù)篇綜述論文總結(jié)了毛發(fā)中精神藥品檢測(cè)方法、毛發(fā)樣品的清洗和提取方法[3]、儀器檢測(cè)方法[4-6]和毛發(fā)檢測(cè)應(yīng)用[7]等.

2014年臺(tái)灣中山醫(yī)科大學(xué)的Chang[8-9]等開(kāi)發(fā)了一種基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的高通量檢測(cè)方法, 可以同時(shí)檢測(cè)冰毒(MA)、苯丙胺(AMP)、3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)、3,4-亞甲基二氧苯丙胺(MDA)及氯胺酮，檢出限在0.5～5.0 pg/mg之間.

2015年韓國(guó)成均館大學(xué)Lee[10]發(fā)展了一種基于LC-MS/MS的毛發(fā)中具有高風(fēng)險(xiǎn)濫用勃起功能障礙藥物的檢測(cè)方法，可以檢測(cè)包括米羅那非、西地那非、他達(dá)拉非、烏地那非和伐地那非以及對(duì)應(yīng)代謝物，并用于監(jiān)控該類藥物的濫用. 另一種基于LC-MS/MS高效液相檢測(cè)毛發(fā)樣本中常見(jiàn)毒品的方法被報(bào)道，該方法可以同時(shí)檢測(cè)15種常見(jiàn)毒品[11]. 香港科技大學(xué)Zhu[12]報(bào)道了使用基于納米微流控芯片與LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)同時(shí)檢測(cè)8種常見(jiàn)毒品及其代謝物的方法，該方法能高效快速地檢測(cè)出毛發(fā)中的目標(biāo)化合物.

盡管毛發(fā)中精神藥物的測(cè)定方法研究取得了一定進(jìn)展，但是目前的方法都只能同時(shí)檢測(cè)少數(shù)常見(jiàn)幾類精神藥物，這無(wú)法滿足吸毒成癮認(rèn)定和戒毒監(jiān)管中精準(zhǔn)高效的檢測(cè)需求. 本文旨在開(kāi)發(fā)一種具有普遍適用性的毛發(fā)中精神藥物的檢測(cè)方法，通過(guò)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)進(jìn)行檢測(cè),能夠?qū)γl(fā)中40種常見(jiàn)精神藥物進(jìn)行定性和定量測(cè)定.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器: Agilent 1290-6470 Triple Quad 高效液相-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)，Cenece@ TDZ5-WS離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，Vortex kylin-bell@5旋渦混合儀(美國(guó))，國(guó)華SHA-C恒溫振蕩器，KQ-250DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

試劑：(-)-Δ9-四氫大麻酚、1R-2S-(-)-鹽酸麻黃堿、2-羥基乙基氟西泮、6-乙酰嗎啡、7-氨基氯硝西泮、7-氨基氟硝西泮、7-氨基硝西泮、α-羥基阿普唑侖、α-羥基咪達(dá)唑侖、α-羥基三唑侖、阿普唑侖、苯丙胺、苯甲酰愛(ài)康寧、溴安定、氯硝西泮、可卡因、可待因、脫烴基氟胺安定、地西泮、2-亞乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷、艾司唑侖、氟硝西泮、氟西泮、海洛因、勞拉西泮、3, 4-亞甲基二氧基苯丙胺、3, 4-亞甲基二氧基乙基苯丙胺、3, 4-亞甲基二氧基甲基苯丙胺、美沙酮、甲基苯丙胺、咪達(dá)唑侖、嗎啡、硝甲西泮、硝西泮、去甲基地西泮、奧沙西泮、替馬西泮、三唑侖、唑吡坦、佐匹克隆標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL)均購(gòu)買自美國(guó)Cerilliant標(biāo)準(zhǔn)品公司；乙腈、甲醇和正己烷為色譜級(jí)，購(gòu)自德國(guó)Merck公司; 乙酸銨、甲酸為質(zhì)譜級(jí)試劑，購(gòu)買自百靈威試劑公司. 試驗(yàn)用水均來(lái)自Milli-Q純水系統(tǒng)，購(gòu)買自法國(guó)Millipore公司.

標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1.0 μg/mL): 分別準(zhǔn)確量取適量40種精神藥物標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中, 用少量甲醇溶解后, 并用甲醇定容至刻度，逐級(jí)稀釋配置成 1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液.

吸毒人員樣本來(lái)源于深圳寶安戒毒所，本項(xiàng)目獲得由深圳市生物醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)的審查批件(深圳倫審[2018]第(001)號(hào))，使用人體生物樣本開(kāi)展研究. 本文涉及五位受試者提供的毛發(fā)樣本，編號(hào)為SZNTMF0001-0005.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell Pak C18(250 mm×2.0 mm，MGII 5 μm)，柱溫：30 ℃， 流速：0.2 μL/min;以含有20 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液的純化水為流動(dòng)相A, 以色譜純乙腈為流動(dòng)相B, 按照表1進(jìn)行梯度洗脫.

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離-正離子模式，檢測(cè)方式為動(dòng)態(tài)多反應(yīng)模式檢測(cè)(DMRM)或多反應(yīng)模式(MRM)檢測(cè)；參數(shù)設(shè)置：噴嘴電壓：500 V；毛細(xì)管電壓：3 500 V；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：5 L/min；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11 L/min；經(jīng)過(guò)對(duì)毛細(xì)管出口去族電壓(DP)、碰撞池能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，最終確定各精神藥物的動(dòng)態(tài)多反應(yīng)模式檢測(cè)參數(shù)如表2所列.

表2 40種精神藥物的動(dòng)態(tài)多反應(yīng)模式檢測(cè)參數(shù)Table 2 Optimized MRM parameters for 40 drugs

續(xù)表2

續(xù)表2

*：定量離子

1.2.3 樣品前處理方法

使用去離子水對(duì)毛發(fā)樣本進(jìn)行粗洗滌，再使用丙酮對(duì)經(jīng)過(guò)粗洗滌的毛發(fā)樣本進(jìn)行精洗滌，毛發(fā)晾干后使用冷凍研磨機(jī)磨碎. 將20 mg磨碎后的毛發(fā)樣本加至1 mL甲醇中70 ℃超聲提取2 h，在2 000～2 800 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，吸取上清液在70 ℃氮?dú)鈸]干，再加入100L甲醇復(fù)溶，上機(jī)檢測(cè).

空白毛發(fā)樣本經(jīng)過(guò)前處理后，使用上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以各種精神藥物均為未檢出進(jìn)行空白確認(rèn)，用于后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及方法精密度和回收率試驗(yàn). 具體步驟為：將20 mg空白毛發(fā)樣本按照上述步驟洗滌，晾干后，剪碎，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線配置要求和空白加標(biāo)試驗(yàn)要求添加相應(yīng)含量的精神藥物標(biāo)準(zhǔn)品，并按照上述步驟超聲提取，揮干，復(fù)溶，上機(jī)檢測(cè).

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

分別對(duì)線性范圍、靈敏度、準(zhǔn)確度和回收率進(jìn)行了考察，同時(shí)以3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度水平(低：10 ng/g，中：50 ng/g，高：200 ng/g)用于準(zhǔn)確度和回收率試驗(yàn).

線性范圍分別使用5個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)質(zhì)量濃度(9、40、90、450、770 ng/g)進(jìn)行曲線擬合，考察相關(guān)系數(shù). 靈敏度通過(guò)方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ)進(jìn)行評(píng)估，制備了一系列遞減濃度的添加毛發(fā)樣本，經(jīng)過(guò)方法前處理后上機(jī)測(cè)定其信噪比，以確定方法檢出限和方法定量限. LOD被確定為信噪比(S/N)接近于3的濃度，LOQ被確定為信噪比(S/N)接近于10的濃度. 準(zhǔn)確度是通過(guò)分別得到低、中、高濃度的6次平行測(cè)定的結(jié)果，并計(jì)算其RSD進(jìn)行評(píng)估. 回收率試驗(yàn)是通過(guò)考察加標(biāo)毛發(fā)樣本的低、中、高濃度的檢測(cè)濃度與實(shí)際添加濃度的百分比所得到.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

C18反向柱是廣泛使用的分離色譜柱，目標(biāo)方法涉及的毒藥品種類繁多，為了保持方法的適用性，我們選擇了Capcell Pak C18(250 mm×2.0 mm，MGII 5 μm). 該柱被廣泛應(yīng)用在食品、化妝品和藥品的有關(guān)成分檢測(cè)中. 為了保證檢測(cè)的靈密度，必須使用梯度洗脫的方法將各個(gè)待測(cè)物質(zhì)盡量分開(kāi)，同時(shí)考慮檢測(cè)效率，將檢測(cè)時(shí)間控制在15 min內(nèi). 通過(guò)方法優(yōu)化，我們最終選擇了1.2.1中所述方法，得到的40種毒藥物的DMRM色譜圖如圖1所示.

圖1 40種毒藥物的DMRM色譜圖Fig. 1 DMRM spectrum of 40 drugs

2.2 樣品前處理優(yōu)化

樣品前處理包括毛發(fā)樣品的清洗處理和毛發(fā)樣本的提取處理[3]. 清洗的目的是除去毛發(fā)表面的污染物質(zhì)，防止其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，目前文獻(xiàn)采取的主要方法為水洗與丙酮洗滌相結(jié)合的方法. 毛發(fā)樣本提取處理方法較多，根據(jù)分析目標(biāo)物的性質(zhì)可采用無(wú)機(jī)酸溶液提取方法，例如1%的磷酸溶液、鹽酸溶液提取，無(wú)機(jī)堿溶液提取(例如5%氫氧化鈉溶液消解提取),有機(jī)溶劑提取(例如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等溶劑提取),混合溶劑提取(例如將無(wú)機(jī)酸溶液和有機(jī)溶劑按照比例混合提取). 以上方法的局限性在于采用的浸泡提取方法所需時(shí)間長(zhǎng)(18～24 h). 我們發(fā)現(xiàn)使用甲醇為溶劑超聲提取可以在短時(shí)間內(nèi)完成提取，回收率滿足要求. 通過(guò)試驗(yàn)考察了超聲提取時(shí)間和提取溫度參數(shù)的影響，最終優(yōu)化的參數(shù)見(jiàn)1.2.3.

2.3 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

線性范圍的考察是通過(guò)選取5個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)質(zhì)量濃度(分別為9、40、90、450、770 ng/g)，每個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)平行測(cè)定6次取平均值進(jìn)行曲線擬合，并得到相關(guān)系數(shù). 靈敏度通過(guò)方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ)進(jìn)行評(píng)估. 具體方法為將添加了一系列遞減濃度的精神藥物標(biāo)準(zhǔn)品的毛發(fā)樣本經(jīng)過(guò)前處理后上機(jī)檢測(cè)，使用信噪比(S/N)接近3時(shí)的濃度確定為方法檢出限(LOD)，使用信噪比(S/N)接近10時(shí)的濃度確定為方法定量限(LOQ)，試驗(yàn)確定相應(yīng)濃度后平行測(cè)定6次取平均值. 結(jié)果顯示該方法對(duì)于40種常見(jiàn)精神藥物的回收率為77.3%～94.3%，在線性范圍(9～770 ng/g)內(nèi)相關(guān)系數(shù)大于0.942， 方法檢出限為0.01～0.8 ng/g，所得數(shù)據(jù)如表3所列.

2.4 方法精密度和回收率

回收率是分別考察3個(gè)加標(biāo)毛發(fā)樣本(質(zhì)量濃度為10、50、200 ng/g)的檢測(cè)(n=6)與實(shí)際質(zhì)量濃度的百分比, 準(zhǔn)確度通過(guò)分別計(jì)算以上低、中、高濃度的6次測(cè)定結(jié)果的RSD進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示各個(gè)待檢目標(biāo)化合物在低、中、高濃度的回收率均高于75%，RSD均在5%以內(nèi)，具體數(shù)據(jù)如表4所列.

2.5 案例應(yīng)用

通過(guò)以上建立的方法，對(duì)吸毒人員的毛發(fā)樣品(SZNTMF0001-0005)進(jìn)行檢測(cè)， 以確定其可能吸食毒品的種類.

2.5.1 案例1(SZNTMF0001)

將20 mg毛發(fā)樣本按照前處理方法處理，提取液上機(jī)檢測(cè)，檢出嗎啡12 ng/g、6-單乙酰嗎啡8 ng/g、可待因10 ng/g、甲基苯丙胺46 ng/g、苯丙胺10 ng/g，DMRM色譜圖如圖2所示.

表3 方法的線性范圍、方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ)Table 3 Linearity, limit of detection and limit of quantification

表4 方法精密度和回收率Table 4 Precision and recovery of method

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

圖2 案例1 DMRM圖譜Fig. 2 DMRM spectra of case 1

2.5.2 案例2(SZNTMF0002)

將20 mg毛發(fā)樣本按照前處理方法處理，提取液上機(jī)檢測(cè)，檢出甲基苯丙胺49 ng/g、苯丙胺10 ng/g，DMRM色譜圖如圖3所示.

2.5.3 案例3(SZNTMF0003)

將20 mg毛發(fā)樣本按照前處理方法處理，提取液上機(jī)檢測(cè)，檢出嗎啡64 ng/g、6-單乙酰嗎啡14 ng/g、可待因13 ng/g，DMRM色譜圖如圖4所示.

圖3 案例2 DMRM圖譜Fig. 3 DMRM spectra of case 2

圖4 案例3 DMRM圖譜Fig. 4 DMRM spectra of case 3

2.5.4 案例4(SZNTMF0004)

將20 mg毛發(fā)樣本按照前處理方法處理，提取液上機(jī)檢測(cè)，檢出嗎啡51 ng/g、6-單乙酰嗎啡16 ng/g、可待因15 ng/g、海洛因11 ng/g，DMRM色譜圖如圖5所示.

圖5 案例4 DMRM圖譜Fig. 5 DMRM spectra of case 4

2.5.5 案例5(SZNTMF0005)

將20 mg毛發(fā)樣本按照前處理方法處理，提取液上機(jī)檢測(cè)，檢出嗎啡84 ng/g、6-單乙酰嗎啡5.6 ng/g、可待因19 ng/g、海洛因13 ng/g、美沙酮16.8 ng/g，DMRM色譜圖如圖6所示.

圖6 案例5 DMRM圖譜Fig. 6 DMRM spectra of case 5

3 結(jié)論

本文建立了一種使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)毛發(fā)中40種常見(jiàn)精神藥物進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)方法. 本方法檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度高，可用于人體毛發(fā)樣本中精神藥物的快速檢測(cè), 為公安民警辦案提供了有力的技術(shù)支持.