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(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所,寧夏銀川 750002; 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,寧夏銀川 750004)
枸杞屬(LyciumL.)屬于茄科(Solanaceae),在全球有80多種枸杞,主要分布在溫帶和亞熱帶地區(qū)。我國分布有7個種和3個變種,主產(chǎn)西北部和北部[1]。其中寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是我國主要的栽種枸杞種,其食用和藥用歷史已經(jīng)有很長時間,在“清肝、明目、補(bǔ)氣”上有著廣泛的應(yīng)用。但是有關(guān)其有效成分的分離鑒定、疾病治療的分子機(jī)制、臨床治療效果和安全性的研究直到最近20年才慢慢受到重視。
近年來,有關(guān)寧夏枸杞,尤其是其主要功效成分枸杞多糖和多種小分子成分在植物學(xué)、藥物化學(xué)、生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中的研究取得了很大的進(jìn)展[2-4]。在一定程度上,促進(jìn)了枸杞產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展,創(chuàng)造了極為可觀的經(jīng)濟(jì)效益。截至2015年底,我國枸杞主要產(chǎn)區(qū)種植面積超過19萬公頃,枸杞干果年產(chǎn)量超過50萬噸。枸杞作為西北地區(qū)特別是寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)之一,在促進(jìn)經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展等方面具有突出的驅(qū)動、支撐和引領(lǐng)作用。
盡管目前枸杞產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展,產(chǎn)業(yè)規(guī)模持續(xù)增長,但仍存在以下問題:第一,枸杞功能物質(zhì)基礎(chǔ)研究薄弱,功能成分的結(jié)構(gòu)表征、構(gòu)效關(guān)系、生物功效與藥理作用機(jī)制不明確;第二,功能成分分離、提取工藝落后,缺乏規(guī)?;苽涔に嚰盎钚员3止に?第三,枸杞產(chǎn)品單一,缺乏高附加值深加工產(chǎn)品等問題,這一現(xiàn)狀使得枸杞加工業(yè)不僅遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于世界發(fā)達(dá)國家的藥食兩用資源加工業(yè)的發(fā)展水平,而且滯后于自身產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要,整體上處于初級發(fā)展階段,成為制約農(nóng)民增收、產(chǎn)業(yè)增效的瓶頸。
因此,枸杞功效成分基礎(chǔ)研究及其分離制備技術(shù)的突破是促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。目前,研究較為深入的枸杞功效成分為多糖、黃酮及類胡蘿卜素等。其中,類胡蘿卜素是在光合生物中發(fā)現(xiàn)的一類天然色素,具有抗氧化性,可以預(yù)防癌癥、心血管疾病和老年黃斑病變。類胡蘿卜素在植物材料中含量和組成差異較大。不同含量和組成的類胡蘿卜素材料其功效活性差異較大。盡管枸杞及其類胡蘿卜素具有抗氧化、保護(hù)眼部、肝臟和心血管系統(tǒng)等作用[5-6],但是由于組成復(fù)雜,難以理清發(fā)揮這些有益效果的主要單體和具體的分子機(jī)制,導(dǎo)致有關(guān)枸杞類胡蘿卜保健機(jī)制研究遲遲未能取得突破,未能像番茄紅素等重要天然產(chǎn)物標(biāo)志單體化合物那樣引起國際研究界的重視。本文圍繞枸杞類胡蘿卜素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,就其結(jié)構(gòu)分類、植物學(xué)代謝特征、功效作用和深加工產(chǎn)品研發(fā)進(jìn)展進(jìn)行簡要的綜述,并對其未來可能的研究與開發(fā)方向和內(nèi)容進(jìn)行展望。
類胡蘿卜素是具有多個共軛雙鍵的萜類化合物,是一類重要的天然色素的總稱,普遍存在于動物、高等植物、真菌、藻類中的黃色、橙紅色或紅色的色素之中。迄今,被發(fā)現(xiàn)的天然類胡蘿卜素已達(dá)600多種,在人體中存在的主要有α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃素、番茄紅素以及β-隱黃素等[6]。根據(jù)目前枸杞類胡蘿卜素研究,枸杞類胡蘿卜素主要有三類組成:第一類,新黃質(zhì)、隱黃質(zhì)、葉黃素、玉米黃素等游離型類胡蘿卜素;第二類,以玉米黃素雙棕櫚酸為主的類胡蘿卜素酯化衍生物;第三類為類胡蘿卜素糖苷化衍生物[7-10]。
Inbaraj等鑒定了枸杞子中2個游離型類胡蘿卜素(玉米黃素和類胡蘿卜素)和7個類胡蘿卜素酯化衍生物(玉米黃素雙棕櫚酸酯、玉米黃素單棕櫚酸酯和隱黃質(zhì)棕櫚酸酯)[7]。Hempel等分析結(jié)果表明,寧夏枸杞綠色未成熟果實(shí)中基本上含有的都是游離型類胡蘿卜素,而成熟果實(shí)中游離型類胡蘿卜素非常少,基本上都被脂肪酸酯化成類胡蘿卜素酯化衍生物[11]。Mia Isabelle等從新加坡收集到的枸杞材料中檢測到的類胡蘿卜素主要為新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和葉黃素,玉米黃素和番茄紅素含量極少[6]。米佳等分析了不同種質(zhì)枸杞鮮果類胡蘿卜素組成情況,結(jié)果表明,9個材料中,其類胡蘿卜素含量和組成差異較大。總體而言,紅果枸杞中的總類胡蘿卜素含量和玉米黃素雙棕櫚酸酯含量顯著高于黃果枸杞。七個紅果枸杞樣品中均沒有檢測到玉米黃素,黃果枸杞中有少量的玉米黃素,其中,新品系15-32和黃果品系3-13的β-隱黃質(zhì)含量顯著高于其它枸杞品種或品系[8]。Chung等[9-10]從中華枸杞果實(shí)甲醇提取物中分離得到了3個類胡蘿卜素糖苷化衍生物,這些化合物的四萜母核上均連有二條糖鏈,且每條糖鏈至少含有3個吡喃阿拉伯糖基,因此極性顯著增大。部分研究報道,寧夏枸杞的主要成分為玉米黃素(玉米黃質(zhì)),這可能和HPLC樣品前處理進(jìn)行皂化導(dǎo)致其他類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成了玉米黃素有關(guān)[12]。
在我國發(fā)現(xiàn)的枸杞七個種包括中華枸杞(LyciumchinenseMill.)、寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)、柱筒枸杞(LyciumcylindricumKuang& A.M.Lu)、新疆枸杞(LyciumdasystemumPojark.)、黑果枸杞(LyciumruthenicumMurray)、截萼枸杞(LyciumtruncatumY.C.Wang)、云南枸杞(LyciumyunnanenseKuang & A.M.Lu)等,三變種包括黃果枸杞(LyciumbarbarumL.var.auranticarpum K.F.Ching)、北方枸杞(LyciumchinenseMill.var.potaniniiPojark.A.M.Lu)和紅枝枸杞(LyciumdasystemumPojark.var.rubricaulium A.M.Lu)。Liu Y等研究表明,在寧夏枸杞和黑果枸杞果實(shí)的發(fā)育早期,葉綠體類胡蘿卜素(葉黃素、β-胡蘿卜素、紫黃質(zhì)等)均有積累,總量為30~50 μg/g鮮重。隨著果實(shí)的發(fā)育成熟,這些類胡蘿卜素逐漸發(fā)生降解。在黑果枸杞果實(shí)的發(fā)育成熟過程中,沒有其他新的類胡蘿卜素成分合成,原有的葉綠體類胡蘿卜素逐漸減少至無。而在寧夏枸杞果實(shí)的發(fā)育成熟過程中,從變色期開始,枸杞類胡蘿卜素逐漸積累(同時還有枸杞類胡蘿卜素的合成前體β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素的少量積累),直至成熟期積累為最大值(約400 μg/g鮮重)[13]。許多不同種或變種枸杞成熟果實(shí)外觀存在顏色差異,其類胡蘿卜素含量和組成也具有較大的差異[8],究其原因可能是色素積累的差異性。
Liu等認(rèn)為,到果實(shí)成熟期時,寧夏枸杞中發(fā)育出了橙色圓形的有色體,但是黑果枸杞中沒有有色體的形成。這可能是黑果枸杞類胡蘿卜素不能合成積累的主要原因。在寧夏枸杞果實(shí)發(fā)育成熟過程中,枸杞類胡蘿卜素合成基因的表達(dá)量有普遍提高的趨勢。表達(dá)量提高比較明顯的基因有DXS2、PSY1、PDS、ZDS、CRTISO、CYC-B和CRTR-B2。這些基因都是枸杞類胡蘿卜素上游的生物合成基因。其中PSY1、CYC-B和CRTR-B2是有色體特異性的類胡蘿卜素生物合成基因,表明寧夏枸杞果實(shí)中明顯存在一條有色體特異性的類胡蘿卜素合成途徑。此外,LCY-E和ZEP的低轉(zhuǎn)錄水平也正好解釋了寧夏枸杞果實(shí)中類胡蘿卜素的含量遠(yuǎn)高于其他類胡蘿卜素類色素含量的原因[13]。
米佳等研究表明,成熟的寧夏枸杞主栽品種,其果實(shí)中類胡蘿卜素含量介于120~400 mg/100 g,是成熟黑果枸杞、黃果枸杞果實(shí)的312倍和9.7倍[8],不同種/變種枸杞的類胡蘿卜素組成差異較大,其中,黃果枸杞也富含類胡蘿卜素,富含游離玉米黃素,且具有不同的品種的黃果枸杞,其類胡蘿卜素總含量也存在顯著差異[8,14-15]。Mia Isabelle等分析的新加坡枸杞中的類胡蘿卜素成分的新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素、玉米黃素和番茄紅素含量分別為82.04、89.43、91.42、4.39、0.19 μg/g[6]。因此,除黑果枸杞、寧夏枸杞外,黃果枸杞等其它種/變種在發(fā)育過程中,其類胡蘿卜素的合成途徑如何,尚需進(jìn)一步研究。
圖1 枸杞類胡蘿卜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖(C72H116O4;CAS號:144-67-2)Fig.1 The chemical structure of Goji carotenoids(C72H116O4;CAS No.:144-67-2)
類胡蘿卜素作為一種營養(yǎng)性抗氧化劑,在動物和人體細(xì)胞中,其抗氧化損傷機(jī)制主要是有兩個,一個是猝滅單線態(tài)氧和以熱的形式散失能量,二是消除自由基以阻礙或終止反應(yīng)鏈的進(jìn)行[16]。有關(guān)類胡蘿卜素抗氧化作用報道較多。枸杞總類胡蘿卜素含量最高,其鮮果類胡蘿卜素含量分別是常見果蔬的3~242倍,寧杞1號干果的類胡蘿卜素提取物總抗氧化能力和FRAP值最高,分別是其它果蔬材料類胡蘿卜素提取物總抗氧化能力的7.04~86.28倍,FRAP值的2.46~23.17倍[15]。ABTS+自由基清除力、FRAP值與總類胡蘿卜素含量呈極顯著正相關(guān)(p<0.01,相關(guān)系數(shù)分別為0.97和0.715)[14]??梢?不同來源的枸杞類胡蘿卜素活性差異較大。枸杞中主要的類胡蘿卜素為玉米黃素(zeaxanthin,3,3′-二羥基-β-胡蘿卜素)、β-胡蘿卜素和β-隱黃質(zhì)(β-cryptoxanthin)的棕櫚酸酯化衍生物,而枸杞各類胡蘿卜素組成抗氧化活性差異性、各化學(xué)組分及抗氧化活性構(gòu)效關(guān)系有待于進(jìn)一步探討闡明。
Kim等[17-18]報道中華枸杞類胡蘿卜素能夠顯著抑制體外培養(yǎng)的大鼠(Rattusnorvegicus)Ito細(xì)胞攝取胸苷和合成膠原的能力,并緩解由四氯化碳引起的Kupffer細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。枸杞類胡蘿卜素的保護(hù)能力與水飛薊素(silybin)相當(dāng)。在膽總管結(jié)扎(bile duct ligation,BDL)制備大鼠繼發(fā)性膽汁淤積性肝纖維化模型中,連續(xù)6周每日口服25 mg/kg的枸杞類胡蘿卜素后,大鼠的一般性肝損傷、肝纖維化程度和肝內(nèi)氧化應(yīng)激壓力均得到了相當(dāng)程度的緩解[19]。 Xiao等利用大鼠慢性酒精性脂肪肝模型研究了枸杞類胡蘿卜素作用效果,結(jié)果表明,枸杞類胡蘿卜素能夠通過調(diào)控MAPK通路顯著改善肝臟損傷[20]。臨床上,在干細(xì)胞培養(yǎng)基中預(yù)處理0.5 mol·L-1枸杞類胡蘿卜素2 h可以顯著提高人源脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在體外抵抗氧化應(yīng)激/炎癥損傷的能力以及治療急性肝衰竭細(xì)胞移植的效率,其主要分子機(jī)制是通過Raf1/MAPK通路精確調(diào)控microRNA-210的表達(dá)水平。若microRNA-210的表達(dá)過低或過高,均會影響干細(xì)胞抵抗逆境的能力和移植治療肝病的效率[21]。
眼保健功效是類胡蘿卜素物質(zhì)主要的功效作用之一。目前研究表明,除了結(jié)構(gòu)相似的β-胡蘿卜素和β-隱黃質(zhì)在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為維生素A,發(fā)揮眼保健作用外[22],玉米黃素與其同分異構(gòu)體葉黃素在子宮內(nèi)和整個生命周期的眼部發(fā)育中起著重要作用,表現(xiàn)為降低年齡相關(guān)眼病發(fā)展的風(fēng)險[23]。究其機(jī)理在于,除了玻璃體、角膜和鞏膜外,幾乎所有的人眼結(jié)構(gòu)都含有葉黃素、玉米黃素和其代謝產(chǎn)物[24]。最高濃度的葉黃素和玉米黃素在眼睛的視網(wǎng)膜黃斑中,在黃斑中心凹處,葉黃素和玉米黃素的濃度比眼睛其他部位高出100倍[25]。葉黃素和玉米黃素在眼部不同部位含量的差異性表明,它們可能發(fā)揮不同的主要生理功能。目前研究的主要功能有五方面:第一,黃斑類胡蘿卜素吸收40%~90%的入射藍(lán)光(取決于濃度)從而保護(hù)視網(wǎng)膜免受光損傷[26-28];第二,作為抗氧化劑,保護(hù)眼部視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)、晶狀體、睫狀體和虹膜等組織的氧化損傷[24,29];第三,抗炎作用,葉黃素通過防止氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和炎癥相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)的增加和通過間接補(bǔ)體激活途徑的限速酶D因子的減少,減緩眼部炎癥[30-32];第四,細(xì)胞間通訊等作用[33-34]。枸杞具有眼保健作用,其提取物具有延遲人類視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞病變的作用[35]。每日飲食補(bǔ)充枸杞漿果90 d可以增加血漿玉米黃素和抗氧化水平,并保護(hù)老年人黃斑中色素沉著減少和軟性玻璃疣累積[36]。但有關(guān)直接應(yīng)用枸杞類胡蘿卜素進(jìn)行眼保護(hù)功效的相關(guān)研究鮮見。
諸多研究通過葉黃素和玉米黃素視網(wǎng)膜組織積累,研究其生物利用度。高效液相色譜法和非侵入性評估尸體解剖組織中的葉黃素和玉米黃素積累水平研究結(jié)果均表明,葉黃素和玉米黃素積累在個體之間變化差異顯著。大量證據(jù)表明,飲食、代謝和遺傳影響對葉黃素和玉米黃素在血液中的運(yùn)輸和眼中的積累、吸收均具有影響[37]。枸杞中主要的類胡蘿卜素成分為棕櫚酸酯化的玉米黃素,關(guān)于其生物利用度研究報道較少。恒河猴(Macacamulatta)連續(xù)服用枸杞子提取物6周后(每日約2 mg枸杞類胡蘿卜素),血漿、肝臟、腎臟、黃斑中玉米黃素的含量相較對照組均有顯著上升,而大腦中的含量并未有顯著變化[38]。而另一項(xiàng)針對人類的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)受試者服用一次(5 mg)來自寧夏枸杞的3R,3′R-枸杞類胡蘿卜素后9~24 h血漿中該化合物達(dá)到峰值,說明酯化的枸杞類胡蘿卜素比非酯化形式的枸杞類胡蘿卜素生物利用率更高[39]。Chung等[40]研究發(fā)現(xiàn),健康志愿者連續(xù)28 d服用寧夏枸杞干果后,其血漿中玉米黃素的濃度比對照組高出2.5倍。且研磨過的枸杞子與熱牛奶(80 ℃)共同服用后,其玉米黃素的生物利用率要顯著高于與熱水(80 ℃)共同服用的方式[41]。因此,推測枸杞類胡蘿卜素在生物體中發(fā)揮作用的單體可能是脫去雙棕櫚酸基團(tuán)的玉米黃素,且受飲食的影響。但是有關(guān)其體內(nèi)代謝和生物利用的具體途徑及相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。
在分析方法上,枸杞類胡蘿卜素主要采用分光光度計(jì)和HPLC法。游離型類胡蘿卜素及其酯化衍生物極性小,除了類胡蘿卜素糖苷化衍生物外,難以用常見的C18反相柱分離,故多數(shù)研究者采用C30柱分析、分離枸杞中該類化合物,并通過HPLC-DAD-APCI/MS等手段定性或定量分析枸杞子中這類成分[8]。隨著枸杞類胡蘿卜素化合物的逐漸明確,采用HPLC結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品即達(dá)到有效的分析目的。但由于該類化合物的極性小的原因,其粗提物提取及HPLC洗脫溶劑主要是己烷、丙酮、石油醚、四氫呋喃、甲基叔丁基醚、二氯甲烷等[7-9],這些溶劑均具有不同程度的毒性。但傳統(tǒng)方法不僅步驟繁瑣,且操作過程中有機(jī)溶劑對人體的傷害較大。限制了枸杞類胡蘿卜素的提取分離及其進(jìn)一步的深加工利用。
米佳等[8]建立了一種枸杞玉米黃素雙棕櫚酸酯含量的快速判斷方法。即利用枸杞顏色特征值估算其玉米黃素雙棕櫚酸酯含量的系數(shù)模型。首先,采用柯尼卡美能達(dá)CM-5分光測色儀進(jìn)行枸杞顏色特征分析,測定時每個枸杞樣品選取5個果實(shí),以白色校正瓷磚為背景,測量枸杞表面亮度(L)、紅度(a)和黃度(b),根據(jù)式(1)、(2)計(jì)算c值和h值。
式(1)
式(2)
然后,根據(jù)所得鮮果枸杞的表皮顏色值L(X1),a(X2),b(X3),c(X4),h(X5),及所建回歸方程Y=-582.221+0.739X1+8.028X2-0.379X3+0.452X4+0.032X5(p=0.006,擬合值R=0.993),估算枸杞中主要化合物玉米黃素雙棕櫚酸酯(Y)的含量[8]。
基于枸杞類胡蘿卜素總體上以極性小的脂溶性化合物為主的原因,其提取制備工藝近年來從溶劑法到超臨界萃取過渡發(fā)展。周學(xué)義輔以乙醇為夾帶劑,獲得了從枸杞、枸杞渣粕中提取玉米黃質(zhì)的超臨界萃取方法[42]。牛東玲、安紹芳獲得了200 g原料的枸杞脂溶性色素的超臨界小量制備工藝:分離壓力為5~11 MPa,分離溫度為30~50 ℃。所得脂溶性成分為β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)和玉米黃素[43]。但枸杞富含小分子糖(主要是果糖和葡萄糖),在萃取溫度達(dá)到35~45 ℃時,造成萃取后料渣黏在一起,且堅(jiān)硬無比地粘在萃取釜中,無法取出,致使損壞萃取釜。生產(chǎn)規(guī)模越大,該現(xiàn)象越嚴(yán)重。而且,目前我國主要栽種寧夏枸杞的寧杞1號、寧杞7號等品種,主要的類胡蘿卜素組分為玉米黃素雙棕櫚酸酯,本課題組采用降糖等工藝,先將枸杞降糖,使枸杞原料總糖含量從41%~45%降低至25%~29%,水含量從11%~12%降低至8%~10%,并保留原料和料渣中的多糖含量仍然≥1.5%。然后取10kg烘干后粉碎至100目,置于超臨界萃取釜中,進(jìn)行萃取,然后合并收集0.6~3 h萃取物,萃取物玉米黃素雙棕櫚酸酯純度達(dá)80%以上。該技術(shù)參數(shù)適應(yīng)于中試放大生產(chǎn)[44]。
目前85%以上的枸杞是以干果形式進(jìn)行市場流通的。Ma等研究表明,制干對枸杞類胡蘿卜素的穩(wěn)定性具有影響,玉米黃質(zhì)二棕櫚酸酯在干燥過程中含量有不同程度的下降,并對生產(chǎn)外觀有影響[45]。一方面,作為枸杞主要的功效成分之一,枸杞類胡蘿卜素具有潛在的多種生理學(xué)功能和保健價值;另一方面,研究主要集中在遺傳代謝途徑、分析測定方法方面,在枸杞類胡蘿卜素深加工方面研究和開發(fā)應(yīng)用鮮見,僅在部分的枸杞籽油的保健產(chǎn)品中,少量含有。究其原因,作者認(rèn)為,除了枸杞類胡蘿卜素中的玉米黃素雙棕櫚酸酯的功效作用及其體內(nèi)代謝途徑等相關(guān)機(jī)理需要進(jìn)一步發(fā)掘,枸杞類胡蘿卜素的穩(wěn)定性和活性保持技術(shù)、提取分離新技術(shù)及加工過程中副產(chǎn)物的綜合利用成為其進(jìn)一步深加工利用的關(guān)鍵。
枸杞類胡蘿卜素含量和組成較復(fù)雜,不同種/變種及品種之間含量及組成差異較大。系統(tǒng)地闡明不同種/變種及品種枸杞類胡蘿卜素的合成機(jī)制有利于進(jìn)一步發(fā)掘枸杞功能基因的有效利用;同時,除了枸杞類胡蘿卜素中的玉米黃素雙棕櫚酸酯的功效作用及其體內(nèi)代謝途徑等相關(guān)機(jī)理需要進(jìn)一步發(fā)掘外,加強(qiáng)枸杞類胡蘿卜素的穩(wěn)定性和活性保持技術(shù)、提取分離生產(chǎn)技術(shù)研究與開發(fā)、集成技術(shù)研發(fā)枸杞類胡蘿卜素保健產(chǎn)品,并對加工過程中副產(chǎn)物進(jìn)行綜合利用,將有利于枸杞物質(zhì)功效成分的深加工利用和枸杞產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步可持續(xù)發(fā)展。