葡萄狀枝瑚菌菌絲液體培養(yǎng)條件優(yōu)化

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(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210023)

葡萄狀枝瑚菌[Ramariabotrytis(Pers.)Ricken]又稱為葡萄色頂枝瑚菌,是一種常見的大型真菌,隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)傘菌綱(Agaricomycetes)釘菇目(Gomphales)釘菇科(Gomphaceae)枝瑚菌屬(Ramaria)[1],夏秋季于林中地上散生,廣泛分布于世界各地。該菌是我國(guó)野生的食用真菌[2],含有16種氨基酸,其中7種是人體必需氨基酸;礦質(zhì)元素和蛋白質(zhì)含量均高于常見的栽培食用菌[3];葡萄狀枝瑚菌還可以藥用,據(jù)張亞光[4]報(bào)道,葡萄狀枝瑚菌具有和胃現(xiàn)氣、破血緩中、祛風(fēng)等作用。

在葡萄狀枝瑚菌的子實(shí)體中還獲得了一些天然產(chǎn)物,Prostenik等[5]從葡萄狀枝瑚菌子實(shí)體中分離獲得了甘油磷脂。Yaoita等[6]從其子實(shí)體種發(fā)現(xiàn)4種已知的甾醇和一種新的神經(jīng)酰胺——(2S,2′R,3R,4E,8E)～N-2′-hydroxyoctadecanoyl-2-amino-9-methyl-4,8-heptade-cadiene-l,3-diol;Sunil K等[7]從子實(shí)體中分離得到兩種水不溶性葡聚糖:(1-3)-α-D-glucan和β-(1-3)-D-glucan;Bhanja等[8]從子實(shí)體堿性提取物中分離出水溶性葡聚糖,該水溶性葡聚糖是一種有效的免疫刺激劑;Li[9]從葡萄狀枝瑚菌子實(shí)體中提取出了粗多糖,并發(fā)現(xiàn)葡萄狀枝瑚菌多糖(RBP)的4個(gè)組分中,RBP-3具有很強(qiáng)的羥基自由基清除活性能力，而RBP-4具有較強(qiáng)的DPPH自由基還原能力。此外,Lee等[10]證實(shí)葡萄狀枝瑚菌子實(shí)體具有明顯的酶活性,其中漆酶的酶活性最高,α-淀粉酶和木聚糖酶相對(duì)較高;Kim等[11]研究發(fā)現(xiàn),葡萄狀枝瑚菌子實(shí)體提取物具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性,這些生物活性的發(fā)現(xiàn)對(duì)于抗癌、抗衰老及治療心血管疾病具有積極的作用。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于葡萄狀枝瑚菌的研究主要集中在其子實(shí)體中的活性物質(zhì)及其活性功能等方面,對(duì)于葡萄狀枝瑚菌液體發(fā)酵的研究報(bào)道較少,而液體發(fā)酵對(duì)于真菌天然產(chǎn)物、生物活性和生產(chǎn)技術(shù)等的研發(fā)都尤為重要,液體發(fā)酵的菌絲和發(fā)酵液具有與子實(shí)體相似的營(yíng)養(yǎng)成分、藥理成分和保健功效,采用液體發(fā)酵技術(shù)獲取菌絲體及發(fā)酵液，不僅可以代替難以栽培的子實(shí)體所具備的功能,也可以相對(duì)縮短生產(chǎn)周期和成本,且工藝簡(jiǎn)單可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。因此,本研究通過單因素和正交試驗(yàn)確定葡萄狀枝菌液體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件,以期為葡萄狀枝瑚菌的液體發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄狀枝瑚菌 2016年7月10日于重慶市黃水鎮(zhèn)魚龍鄉(xiāng)七月山采集葡萄狀枝瑚菌子實(shí)體,按照張攻等[12]的方法自行通過組織分離和純化培養(yǎng)獲得,保存于本實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱;葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母粉KNO3、NaNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、KH2PO4、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、VB1、VB2、VB3、VB6、VB9、VB11分析純,上海生工生物技術(shù)有限公司;馬鈴薯 采購(gòu)于當(dāng)?shù)靥K果超市。

CXZ型智能光照培養(yǎng)箱 南京同立實(shí)驗(yàn)有限公司;CA-1390-1垂直層流超凈工作臺(tái) 上海上凈設(shè)備有限公司;JA1003電子天平 上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司;SHZ-D III循環(huán)水真空泵 鞏義市英裕予華儀器廠;HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋 Hirayama manufacturing corporation;QHZ-123B疊加恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海百典儀器設(shè)備有限公司;DZF-6090真空干燥箱 上海雙旭電子有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試培養(yǎng)基的配制 PDA加富培養(yǎng)基:200 g馬鈴薯,20 g葡萄糖,3 g蛋白胨,0.8 g KH2PO4,1.2 g MgSO4·7H2O,0.01 g VB1,1000 mL蒸餾水,pH自然[13];種子培養(yǎng)基:20 g葡萄糖,3 g蛋白胨,0.8 g KH2PO4,1.2 g MgSO4·7H2O,0.01 g VB1,1000 mL蒸餾水,pH自然;無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基:3 g蛋白胨,0.8 g KH2PO4,0.01 g VB1,1000 mL蒸餾水,pH自然;無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基:20 g可溶性淀粉,0.8 g KH2PO4,0.01 g VB1,1000 mL蒸餾水,pH自然;基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅰ:20 g可溶性淀粉、3 g酵母粉、0.01 g VB1,1000 mL蒸餾水,pH自然;基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅱ:20 g可溶性淀粉、3 g酵母粉、0.8 g KH2PO4、1.2 g FeSO4·7H2O、1.2 g MgSO4·7H2O,1000 mL蒸餾水,pH自然。

1.2.2 液體菌種的制備 按常規(guī)方法將保藏的葡萄狀枝瑚菌母種從試管接種到PDA加富培養(yǎng)基平板中,23 ℃活化培養(yǎng)7 d后，以1 cm的打孔器取5片葡萄狀枝瑚菌，接入裝瓶量為50 mL/250 mL錐形瓶種子培養(yǎng)基中,靜置培養(yǎng)2 d后,23 ℃,160 r/min培養(yǎng)7 d得葡萄狀枝瑚菌種子液。

1.2.3 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)量影響的測(cè)定 用葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇、可溶性淀粉6種碳源,分別以20 g加入1 L無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基,pH自然,每瓶(50 mL/250 mL)接種量10%(V/V),接種后在23 ℃下、160 r/min搖床培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量,確定最有利于菌絲生長(zhǎng)的碳源;在最優(yōu)碳源下，考察碳源濃度(15、20、25、30、35 g/L)對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響，確定最佳碳源濃度。

1.2.4 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)量影響的測(cè)定 用KNO3、NaNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、蛋白胨和酵母粉6種氮源,分別以3 g加入1 L無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基,pH自然,每瓶(50 mL/250 mL)接種量10%(V/V),接種后在23 ℃下、160 r/min搖床培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量,確定最有利于菌絲生長(zhǎng)的氮源;在最優(yōu)氮源下，考察氮源濃度(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 g/L)對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響，確定最佳氮源濃度。

1.2.5 無機(jī)離子對(duì)菌絲生長(zhǎng)量影響的測(cè)定 分別以0.8 g KH2PO4、1.2 g FeSO4·7H2O、1.2 g MgSO4·7H2O、1.2 g FeSO4·7H2O+1.2 g MgSO4·7H2O、0.8 g KH2PO4+1.2 g FeSO4·7H2O+1.2 g MgSO4·7H2O、0.8 g KH2PO4+1.2 g MgSO4·7H2O,加入1 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅰ,pH自然,每瓶(50 mL/250 mL)接種量10%(V/V),接種后在23 ℃下、160 r/min搖床培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量,確定最有利于菌絲生長(zhǎng)的無機(jī)離子;在最優(yōu)無機(jī)離子下，考察無機(jī)離子濃度(2.6、3.2、3.8、4.4、5.0 g/L)對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響，確定最佳無機(jī)離子濃度。

1.2.6 生長(zhǎng)因子對(duì)菌絲生長(zhǎng)量影響的測(cè)定 用VB1、VB2、VB3、VB6、VB9和VB116種維生素作為生長(zhǎng)因子,分別以0.01 g加入1 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅱ,pH自然,每瓶(50 mL/250 mL)接種量10%(V/V),接種后在23 ℃下、160 r/min搖床培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量,確定最有利于菌絲生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子;在最優(yōu)生長(zhǎng)因子下，考察生長(zhǎng)因子濃度(0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 g/L)對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響，確定最佳生長(zhǎng)因子濃度。

1.2.7 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)量影響的測(cè)定 供試培養(yǎng)基為搖瓶種子培養(yǎng)基,滅菌前以1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將初始pH分別調(diào)節(jié)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,每瓶(50 mL/250 mL)接種量10%(V/V),接種后在23 ℃下、160 r/min搖床培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量,確定最有利于菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基初始pH。

1.2.8 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)量影響的測(cè)定 供試培養(yǎng)基同1.2.7,pH6.5,每瓶(50 mL/250 mL)接種量10%(V/V),接種后分別在全黑暗、全光照和半光照(12 h光照,12 h黑暗)3種處理下,23 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量,確定最有利于菌絲生長(zhǎng)的光照條件。

1.2.9 培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)量影響的測(cè)定 供試培養(yǎng)基同1.2.8,每瓶(50 mL/250 mL)接種量10%(V/V),接種后全黑暗條件下分別在17、20、23、26、29、32 ℃下,160 r/min搖床培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量,確定最有利于菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)溫度。

1.2.10 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)量影響的測(cè)定 供試培養(yǎng)基同1.2.8,每瓶(50 mL/250 mL)接種量10%(V/V),接種后全黑暗條件下分別以120、140、160、180、200、220、240 r/min的搖床轉(zhuǎn)速,在23 ℃下?lián)u床培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量,確定最有利于菌絲生長(zhǎng)的搖床轉(zhuǎn)速。

1.2.11 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳因素后,采用L9(34)正交表以葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量為指標(biāo),選取可溶性淀粉為碳源,酵母粉為氮源,KH2PO4+FeSO4·7H2O+MgSO4·7H2O組合為無機(jī)離子,VB1為生長(zhǎng)因子,安排正交試驗(yàn),以進(jìn)一步優(yōu)化葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)基組成,液體培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基初始pH6.5,裝瓶量50 mL/250 mL錐形瓶,接種量10%(V/V),全黑暗培養(yǎng)7 d,試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 液體培養(yǎng)基正交試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for liquid medium

1.2.12 菌絲生長(zhǎng)量的測(cè)定 培養(yǎng)結(jié)束后將每瓶發(fā)酵液進(jìn)行真空抽濾收集菌絲,55 ℃恒溫烘箱中烘干4 h至恒重,用電子天平恒重。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS 13.0軟件和Origin 8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖,利用one way ANOVA的LSD檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,顯著性水平為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響

葡萄狀枝瑚菌對(duì)碳源的利用比較廣泛,既可以利用成分復(fù)雜的有機(jī)氮源,又可以利用單糖和雙糖等小分子碳源,6種供試的碳源對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響存在顯著性差異(圖1),說明其對(duì)碳源的利用具有選擇性。以蔗糖為碳源時(shí),菌絲生長(zhǎng)量最低,為0.253 g/50 mL;以可溶性淀粉為碳源時(shí),菌絲生長(zhǎng)量最大,為0.39 g/50 mL,且與其他5種碳源之間差異顯著(p<0.05),供給可溶性淀粉時(shí)菌絲生長(zhǎng)量大,葡萄狀枝瑚菌更傾向于利用有機(jī)碳源,說明能夠迅速產(chǎn)生相應(yīng)的水解酶,從而將大分子降解成小分子供其生長(zhǎng)所需,因此,葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)基的最佳碳源為可溶性淀粉。

圖1 碳源對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the dry mycelial weight of Ramaria botrytis注:圖中不同字母代表差異顯著性(p<0.05),下圖相同。

如圖2所示,隨著可溶性淀粉濃度的升高,葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量也隨之升高,當(dāng)可溶性淀粉濃度為25 g/L時(shí),菌絲生長(zhǎng)量最大,為0.416 g/50 mL,添加的可溶性淀粉濃度超過25 g/L時(shí),菌絲生長(zhǎng)量隨著可溶性淀粉濃度的升高而逐漸降低,可能是由于培養(yǎng)基中可溶性淀粉濃度過大,導(dǎo)致發(fā)酵液的粘度增大,影響了溶氧和其他物質(zhì)的傳遞,進(jìn)而影響了菌絲生長(zhǎng),所以選擇25 g/L為最佳可溶性淀粉濃度。

圖2 可溶性淀粉濃度對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.2 Effect of different concentrations of soluble starch on the dry mycelial weight of Ramaria botrytis

2.2 氮源對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響

圖3 氮源對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the dry mycelial weight of Ramaria botrytis

如圖4所示,隨著酵母粉濃度的升高,葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量也隨之升高,當(dāng)酵母粉濃度為3.5 g/L時(shí),菌絲生長(zhǎng)量最大,為0.483 g/50 mL,當(dāng)酵母粉濃度超過3.5 g/L時(shí),菌絲生長(zhǎng)量隨著酵母粉濃度的升高而逐漸降低,所以選擇3.5 g/L為最佳酵母粉濃度。

圖4 酵母粉濃度對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of yeast extract on the dry mycelial weight of Ramaria botrytis

2.3 無機(jī)離子對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響

無機(jī)鹽是影響食用菌生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一,孟麗等[17]研究表明,低濃度的FeSO4·7H2O可以促進(jìn)雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)和黃背木耳(Auriculariapolytricha)等擔(dān)子菌菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育;康健等[18]研究發(fā)現(xiàn),向培養(yǎng)基中添加0.1%的KH2PO4和0.5%的MgSO4時(shí),香菇(Lentinulaedodes)菌絲的濕重達(dá)到最大。本實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)基中分別添加6個(gè)供試的無機(jī)離子組合，其對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響存在差異(圖5),添加MgSO4·7H2O時(shí),菌絲生長(zhǎng)量最低,為0.339 g/50 mL;添加KH2PO4+FeSO47H2O+MgSO4·7H2O時(shí)菌絲生長(zhǎng)量最大,為0.883 g/50 mL,且與添加其他5個(gè)供試的無機(jī)離子處理之間差異顯著(p<0.05);K+、Mg2+、Fe2+三者共同添加到培養(yǎng)基中比單獨(dú)添加其中一種離子的效果好,這證實(shí)了張焱珍等基于對(duì)荷葉離褶傘(Lyophyllumdecasters)的研究而提出的觀點(diǎn)[19],這三個(gè)離子間的互作可以顯著提高菌絲的生長(zhǎng)量,因此,KH2PO4+FeSO47H2O+MgSO4·7H2O無機(jī)離子組合為葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)基的最佳無機(jī)離子。

圖5 無機(jī)離子對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.5 Effects of different inorganic ions on the dry mycedial weight of Ramaria botrytis注:K+Mg為KH2PO4+MgSO4·7H2O,Fe+Mg為FeSO4·7H2O+MgSO4·7H2O,K+Fe+Mg為KH2PO4+FeSO4·7H2O+MgSO4·7H2O。

如圖6所示,葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量隨著KH2PO4+FeSO4·7H2O+MgSO4·7H2O組合濃度的升高而升高,當(dāng)KH2PO4+FeSO4·7H2O+MgSO4·7H2O組合濃度為3.8 g/L(即KH2PO4+FeSO4·7H2O+MgSO4·7H2O為1.0 g/L+1.4 g/L+1.4 g/L)時(shí),菌絲生長(zhǎng)量最大,為1.011 g/50 mL,當(dāng)KH2PO4+FeSO4·7H2O+MgSO4·7H2O組合濃度濃度超過3.8 g/L時(shí),菌絲生長(zhǎng)量隨著酵母粉濃度的升高而逐漸降低,所以選擇3.8 g/L為最佳無機(jī)離子組合濃度。

圖6 KH2PO4+FeSO4·7H2O+MgSO4·7H2O組合濃度對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.6 Effects of different concentrations of KH2PO4+FeSO4·7H2O+MgSO4·7H2O on the dry mycelial weight of Ramaria botrytis

2.4 生長(zhǎng)因子對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響

據(jù)相關(guān)資料報(bào)道,真菌是VB的天然缺陷型,在真菌中以輔酶的形式存在,需要的量很少,但對(duì)真菌的生長(zhǎng)至關(guān)重要,必須由外界添加才能更好生長(zhǎng)[20]。培養(yǎng)基中分別添加6種不同的維生素，其對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響存在差異(圖7)。以VB3為生長(zhǎng)因子時(shí),菌絲生長(zhǎng)量最低,為0.572 g/50 mL;以VB1為生長(zhǎng)因子時(shí)菌絲生長(zhǎng)量最大,為1.12 g/50 mL,且VB1為生長(zhǎng)因子時(shí)與其他5種生長(zhǎng)因子之間差異顯著(p<0.05),因此,VB1為葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)基的最佳生長(zhǎng)因子。

圖7 生長(zhǎng)因子對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.7 Effects of different growth factors on the dry mycelial weight of Ramaria botrytis

如圖8所示,當(dāng)VB1濃度為0.015 g/L時(shí),菌絲生長(zhǎng)量最大,為1.161 g/50 mL,當(dāng)VB1濃度大于0.015 g/L時(shí)，菌絲生長(zhǎng)量隨著VB1濃度的升高而逐漸降低,高濃度的VB1對(duì)菌絲的生長(zhǎng)有抑制作用,因此選擇0.015 g/L為最佳VB1濃度。

圖8 VB1濃度對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.8 Effects of different concentrations of VB1 on the dry mycelial weight of Ramaria botrytis

2.5 培養(yǎng)基初始pH對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響

培養(yǎng)基的初始pH對(duì)葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)下的菌絲生長(zhǎng)量有著不同程度的影響(圖9)。在低pH時(shí),菌絲生長(zhǎng)量隨著pH升高而逐漸增大,初始pH6.5時(shí),菌絲生長(zhǎng)量最大,為0.603 g/50 mL,并且與其他5個(gè)初始pH處理之間差異顯著(p<0.05);pH6.5之后,菌絲生長(zhǎng)量隨著pH升高而快速減小,初始pH8.0時(shí),菌絲生長(zhǎng)量最低,為0.2517 g/50 mL,表明該菌的生長(zhǎng)對(duì)堿性條件十分敏感,而更喜好偏酸性的條件,這與Fang等[21]對(duì)于Ganodermalucidum液體培養(yǎng)初始pH的探究結(jié)論相同,因此,確定葡萄狀枝瑚菌菌絲體生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基初始pH為6.5。

圖9 培養(yǎng)基初始pH對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.9 Effect of initial medium pH on the dry mycelial weight of Ramaria botrytis

2.6 光照條件對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響

葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)時(shí),菌絲在光照和黑暗條件下的生長(zhǎng)量存在顯著差異(p<0.05)(圖10)。24 h完全光照培養(yǎng)條件下,菌絲生長(zhǎng)量最小,為0.758 g/50 mL;24 h完全黑暗培養(yǎng)時(shí)菌絲生長(zhǎng)量最大,為0.827 g/50 mL,且與其他兩種光照處理之間差異顯著(p<0.05),這與Vargos-Isla[22]對(duì)一種分離自巴西的野生食用菌的研究結(jié)果一致,Lentinusstrigosus的液體培養(yǎng)也是在黑暗條件下生長(zhǎng)最好,但其中的機(jī)理還有待研究。

圖10 光照條件對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.10 Effects of light and dark on the dry mycelial weight of Ramaria botrytis

2.7 培養(yǎng)溫度對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響

栽培食用菌根據(jù)菌絲體最適生長(zhǎng)溫度分為低溫菌(21～24 ℃)、中溫菌(25～26 ℃)和高溫菌(32～35 ℃)[23],葡萄狀枝瑚菌在不同的培養(yǎng)溫度下,菌絲生長(zhǎng)量存在顯著差異(圖11),菌絲生長(zhǎng)量在23 ℃時(shí)達(dá)到最大,為0.842 g/50 mL,且與其他5個(gè)培養(yǎng)溫度間差異顯著(p<0.05),23 ℃是其最適培養(yǎng)溫度,由此可以判斷出葡萄狀枝瑚菌屬于低溫菌。高于23 ℃的溫度處理,對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)都有著一定的抑制作用,32 ℃中培養(yǎng),菌絲生長(zhǎng)量最小,僅為0.083 g/50 mL,可能是高溫抑制了菌絲體細(xì)胞內(nèi)酶的活性,影響了菌絲的正常生長(zhǎng),使得菌絲生長(zhǎng)量明顯降低,因此,23 ℃為葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)的最適溫度。

圖11 培養(yǎng)溫度對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.11 Effect of the temperature on the dry mycelial weight of Ramaria botrytis

2.8 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響

搖床轉(zhuǎn)速影響培養(yǎng)液的氧氣供應(yīng),也顯著的影響葡萄狀枝瑚菌菌絲體的生長(zhǎng),不同轉(zhuǎn)速影響葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)中的菌絲生長(zhǎng)量(圖12)。當(dāng)轉(zhuǎn)速為120～220 r/min時(shí),菌絲生長(zhǎng)量隨著轉(zhuǎn)速的增大而增大。220 r/min時(shí),達(dá)到最大的菌絲生長(zhǎng)量,為1.077 g/50 mL,且與前5個(gè)轉(zhuǎn)速間差異顯著(p<0.05)。在遞增的轉(zhuǎn)速條件下,菌絲生長(zhǎng)量也逐漸增加,表面該菌是一種生長(zhǎng)時(shí)需要提供足夠氧氣的真菌。當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到240 r/min時(shí),菌絲生長(zhǎng)量?jī)H為0.187 g/50 mL,低于120 r/min時(shí)的0.326 g/50 mL,可能是由于轉(zhuǎn)速過高,剪切力大,不利于菌絲的生長(zhǎng)和菌絲球的形成[24],因此,適合葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)的最佳搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min。

圖12 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)葡萄狀枝瑚菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.12 Effect of different rotational speeds of the culture table on the dry mycelial weight of Ramaria botrytis

2.9 正交試優(yōu)化葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)基

通過表2中K1、K2、K3的大小，可判斷A、B、C、D各因素對(duì)本實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)大小的影響程度。以菌絲平均生長(zhǎng)量為試驗(yàn)指標(biāo),根據(jù)極差值R的大小,可以判斷個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響主次,上表的計(jì)算結(jié)果可見,極差值R由大到小依次為A>C>B>D,所以主次因素的影響順序應(yīng)為A>C>B>D。由以上對(duì)于K和R的計(jì)算與分析，可以得出本實(shí)驗(yàn)中水平最優(yōu)的組合是A2B2C3D1,即1L液體培養(yǎng)基的組成為25 g可溶性淀粉,3.5 g酵母粉,4.4 g(1.2 g KH2PO4+1.6 g FeSO4·7H2O+1.6 g MgSO4·7H2O)無機(jī)離子,0.01 g VB1。

表2 葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析Table 2 The orthogonal test and range analysis of the optimum medium for the liquid culture of Ramaria botrytis

2.10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

依照正交試驗(yàn)確定的葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方,1 L液體培養(yǎng)基中25 g可溶性淀粉,3.5 g酵母粉,4.4 g(1.2 g KH2PO4+1.6 g FeSO4·7H2O+1.6 g MgSO4·7H2O)無機(jī)離子,0.01 g VB1配置液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基初始pH6.5,每瓶(50 mL/250 mL)葡萄狀枝瑚菌種子液接種量10%(V/V),在23 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min下全黑暗培養(yǎng)7 d,所得菌絲生長(zhǎng)量為(26.8±0.29) g/L。

3 討論

為了進(jìn)行食用菌的液體發(fā)酵,不論是野生的還是栽培的,考察碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)要素與溫度、pH、氧氣和光照等培養(yǎng)條件的影響是必要的[25-26],從液體培養(yǎng)葡萄狀枝瑚菌(Ramariabotrytis)的菌絲生長(zhǎng)量來看,與其它大型食用真菌的情況類似[15,22],不同營(yíng)養(yǎng)要素和不同培養(yǎng)條件對(duì)其生長(zhǎng)的影響存在差異。通過本實(shí)驗(yàn)中的液體培養(yǎng)條件進(jìn)行對(duì)葡萄狀枝瑚菌進(jìn)行培養(yǎng),其菌絲生長(zhǎng)量可達(dá)(26.8±0.29) g/L,遠(yuǎn)高于Tae-Hee等[27]經(jīng)過30 d液體培養(yǎng)葡萄狀枝瑚所得到的最大產(chǎn)量19.23 g/L,在提高了菌絲產(chǎn)量的同時(shí)縮短了液體培養(yǎng)的時(shí)間。但刑仁昌等[28]液體培養(yǎng)蒙古口蘑(Tricholomamongolicum),最適培養(yǎng)條件下菌絲生長(zhǎng)量為30 g/L;易千紅等[29]對(duì)黃枝瑚菌(Ramariaflava)進(jìn)行液體培養(yǎng),最適條件下菌絲生長(zhǎng)量為42.6 g/L,與上述幾種擔(dān)子菌液體培養(yǎng)后菌絲生長(zhǎng)量相比,本實(shí)驗(yàn)中葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)后的最大產(chǎn)量仍然有待提高。因此,我們將在今后的研究中擴(kuò)大對(duì)碳源、氮源、無機(jī)離子和生長(zhǎng)因子的篩選范圍,并通過優(yōu)化試驗(yàn),以提高葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)量。

4 結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn),確定了有利于葡萄狀枝瑚菌液體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為1 L液體培養(yǎng)基中含25 g可溶性淀粉,3.5 g酵母粉,4.4 g(1.2 g KH2PO4+1.6 g FeSO4·7H2O+1.6 g MgSO4·7H2O)無機(jī)離子,0.01 g VB1;最佳培養(yǎng)條件為:23 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí),培養(yǎng)基初始pH6.5,裝瓶量50 mL/250 mL錐形瓶,接種量10%(V/V),全黑暗培養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為葡萄狀枝瑚菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方優(yōu)化以及發(fā)酵條件提供了依據(jù)。