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    超高效合相色譜法測定魚肝油中維生素D3含量

    2018-12-26 12:09:28楊桂秋吳文杰吳寒秋
    關(guān)鍵詞:出峰魚肝油背壓

    陳 虹, 楊桂秋, 吳文杰, 吳寒秋, 程 燕

    (1.沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院, 遼寧 沈陽 110142; 2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院食品安全研究所, 北京 100176)

    魚肝油是一種從鮫類動物Squahdae等無毒海魚肝臟中提出的一種脂肪油[1],其中維生素D3是魚肝油中主要的營養(yǎng)物質(zhì)之一.維生素D3有助于促進(jìn)小腸粘膜對鈣的吸收,能夠預(yù)防佝僂病和骨樣組織鈣化障礙等疾病[2-3],然而,維生素?cái)z入過量也導(dǎo)致健康風(fēng)險(xiǎn)[4].因此,測定魚肝油維生素對評價(jià)魚肝油品質(zhì)優(yōu)劣、合理使用魚肝油具有現(xiàn)實(shí)意義.

    脂溶性維生素的檢測有很多種方法:液相色譜法[5-6]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7-9]、分光光度法[10]、毛細(xì)管電動色譜法[11]等.最常見的檢測魚肝油中維生素D3含量的方法主要是液相色譜法.液相色譜法與分光光度法比較優(yōu)勢在于可以對復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行在線分離并定量定性,能排除樣品基質(zhì)中部分干擾.液相色譜法相比于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法而言儀器設(shè)備經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,操作和儀器維護(hù)相對簡單,可以滿足本實(shí)驗(yàn)對目標(biāo)物的檢出限和精密度檢測要求.食品中維生素的檢測主要依據(jù)《GB 5413.9—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中VA、VD、VE的測定》[12].然而國標(biāo)中試樣經(jīng)皂化后用石油醚提取,用正相色譜凈化,反相色譜分離,外標(biāo)法定量.該方法操作復(fù)雜,耗時(shí)長,而且干擾物質(zhì)較多,容易造成維生素被破壞,導(dǎo)致回收率下降.

    文獻(xiàn)報(bào)道正相色譜檢測魚肝油中的維生素D3前處理簡單[13],能夠簡化操作步驟.waters超高效合相色譜(UPC2)是2012年面世的新型正相色譜,它具有傳統(tǒng)高效液相色譜和超臨界流體色譜的優(yōu)點(diǎn)[14],以二氧化碳為流動相主體,依靠CO2的溶劑化能力對目標(biāo)物進(jìn)行分離、分析[15],具有有機(jī)溶劑使用量少、分析速度快、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[16-17].合相色譜作為一種新技術(shù)能夠完全替代正相液相色譜,合相色譜分離成本僅為液相色譜的十分之一;其靈敏度比正相液相色譜高,分離效果更好,分析速度快,能夠分離液相色譜難以分開的同分異構(gòu)體組分,還能分析傳統(tǒng)液相色譜難保留或難洗脫的成分(比如多糖).合相色譜與氣相色譜相比,當(dāng)分析揮發(fā)油、油脂類樣品時(shí),合相色譜能簡化前處理步驟,避免了衍生化,大大提高了檢測效率.目前國內(nèi)沒有應(yīng)用超高效合相色譜檢測魚肝油基質(zhì)中維生素D3含量的文獻(xiàn)報(bào)道.本文采用超高效合相色譜法測定魚肝油中維生素D3含量,樣品經(jīng)正己烷提取后上樣,能夠大大簡化樣品預(yù)處理步驟,縮短分析時(shí)間,具有預(yù)處理簡單、耗時(shí)短、靈敏度高、回收率高等優(yōu)點(diǎn),為復(fù)合魚肝油制劑的質(zhì)量控制提供一種新方法.

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑、材料

    Waters超高效合相色譜,美國 waters公司,檢測波長設(shè)置為265 nm;Allegra X-22R 冷凍離心機(jī),美國Beckman Coulter公司;VORTEX-5 渦旋混合器,海門市Kylin-Bell公司; 維生素D3,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98 %,德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司; 甲醇、乙腈、異丙醇、正己烷,色譜純,美國Thermo Fisher 公司;6種魚肝油樣品,購于當(dāng)?shù)厮幍?中國,北京).

    1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取維生素D310.0 mg,加入到10 mL容量瓶中,用正己烷定容到10 mL,待其完全溶解,配制成 1 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,避光儲存在-25 ℃冰箱中待用.

    標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確吸取5 mL、2 mL、1 mL、500 μL、200 μL、100 μL、50 μL、20 μL、10 μL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL 容量瓶中,用正己烷定容成質(zhì)量濃度分別為500 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L和1 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液,置于棕色樣品瓶,避光儲存在-4 ℃冰箱中,平均每4 h重新配制一次.

    1.3 超高效合相色譜條件

    色譜柱:Waters Acquity UPC2Torus 1-AA(100 mm×3.0 mm,1.7 μm),流動相:A 為 CO2,B 為甲醇; 體積分?jǐn)?shù)為80 %的CO2等度洗脫.采集時(shí)間3 min;流速 1 mL/min; 進(jìn)樣量 1 μL; 柱溫 50 ℃ ; 檢測波長 265 nm; 動態(tài)背壓(ABPR):15.169 MPa.

    1.4 樣品處理

    前處理參考相關(guān)文獻(xiàn)[13],采用正己烷直接提取稀釋上樣.準(zhǔn)確稱取 1.0 g魚肝油樣品于 50 mL 聚乙烯管中,加入 10 mL正己烷,用渦旋混勻后,高速冷凍離心機(jī)于 4 ℃ 下以7 500 r/min 離心 5 min,取 1 mL 上清液,經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾后,經(jīng)超高效合相色譜分析.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 色譜條件的優(yōu)化

    比較3種Waters Acquity UPC2常用色譜柱: Waters Acquity UPC2BEH(150 mm×2.1 mm,1.7 μm),Waters Acquity UPC2Torus 1-AA柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μm) 和Waters Acquity UPC2Torus 2-PIC柱(150 mm×2.1 mm,1.7 μm).3種色譜柱都能在5 min內(nèi)出峰完全.由表1可知:使用 BEH柱和2-PIC柱時(shí),維生素D3的對稱因子是1.57和1.71,峰面積分別為31 428和33 728;而使用1-AA柱時(shí),維生素D3的對稱因子是1.48,峰面積是30 240.對稱因子越接近1 說明峰型越對稱,峰型越好.由圖1可知:當(dāng)使用BEH和2-PIC柱時(shí),維生素D3在1 min左右出峰,雜質(zhì)峰通常在1 min之前出現(xiàn).出峰過早容易與雜質(zhì)一起出峰,在實(shí)際檢測中影響檢測結(jié)果,所以,使用BEH和2-PIC柱不合適.使用1-AA柱時(shí),維生素D3在1.8 min左右出峰,目標(biāo)物的峰與雜質(zhì)峰、溶劑峰等能夠很好地分開.綜上所述,使用1-AA柱時(shí)維生素D3的響應(yīng)更高,峰型更好,出峰時(shí)間更合適.因此,色譜柱選擇Waters Acquit UPC2Torus 1-AA柱.

    表1 不同色譜柱下維生素D3的峰面積和對稱因子Table 1 Peak area and symmetry factors of vitamin D3 with different chromatographic columns

    圖1 不同色譜柱上維生素D3色譜圖Fig.1 Chromatogram of vitamin D3 with different chromatographic columns

    2.2 流動相中助溶劑的優(yōu)化

    CO2超臨界流體作為超高效合相色譜的流動相,因?yàn)槠錁O性過低,通常加入甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈等有機(jī)溶劑作為助溶劑.助溶劑能夠調(diào)整流動相極性,改變流動相對目標(biāo)物的溶解能力,影響目標(biāo)化合物的保留時(shí)間并改善目標(biāo)化合物的峰型[18].比較4種常用助溶劑:甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈,考察助溶劑對維生素D3峰型及保留時(shí)間的影響,選擇最優(yōu)助溶劑.結(jié)果如圖2所示.

    圖2 不同助溶劑下維生素D3色譜圖Fig.2 Chromatogram of vitamin D3 with different solvents

    不同助溶劑對維生素D3的峰型影響不大,但是對維生素D3的保留時(shí)間影響明顯.當(dāng)使用甲醇為助溶劑時(shí),維生素D3在1.5~2 min 之間出峰;當(dāng)使用助溶劑為乙醇、異丙醇和乙腈時(shí),維生素D3的保留時(shí)間均大于2 min.因此,可以看出選擇甲醇為助溶劑能節(jié)省分析時(shí)間,故最終選擇甲醇為助溶劑.

    2.3 系統(tǒng)背壓的優(yōu)化

    系統(tǒng)背壓是超高效合相色譜重要參數(shù)之一.其主要作用是控制流動相密度和性能,改變流動相的洗脫能力和性能[15]. CO2超臨界流體的密度和黏度隨著背壓的增加而增加,會導(dǎo)致柱壓升高[17],所以,選擇合適背壓非常重要.考察了12.411 MPa、13.790 MPa、15.169 MPa和16.548 MPa 4種背壓下CO2超臨界流體對目標(biāo)物保留時(shí)間和峰型的影響.結(jié)果如表2.由表2可知:當(dāng)背壓為12.411 MPa時(shí),維生素D3的保留時(shí)間為1.24 min,對稱因子為1.34;當(dāng)背壓為15.169 MPa時(shí),維生素D3的保留時(shí)間為1.19 min,對稱因子為1.19.通過比較保留時(shí)間和對稱因子,可以看出當(dāng)柱壓為15.169 MPa時(shí),雖然和其他條件相比維生素D3的出峰時(shí)間相差不大,但是維生素D3峰型更好;而當(dāng)柱壓為16.548 MPa時(shí),色譜柱壓力過高.通過對保留時(shí)間、峰型及色譜柱壓力的綜合考慮,最終選擇背壓為15.169 MPa.

    表2 不同系統(tǒng)背壓下維生素D3的保留時(shí)間和對稱因子Table 2 Retention time and symmetry factors of vitamin D3 with different dynamic pressures

    2.4 色譜柱溫度的優(yōu)化

    溫度也能夠影響目標(biāo)物的峰型和保留時(shí)間.在30 ℃、40 ℃、50 ℃下考察柱溫對目標(biāo)物分離的影響.結(jié)果表明:隨著溫度的變化,維生素D3的保留時(shí)間并沒有明顯差異,但是,當(dāng)溫度為 30 ℃時(shí),柱壓較高,基線噪音較大,重現(xiàn)性較差;當(dāng)溫度為40 ℃時(shí),基線噪音有所減??;當(dāng)溫度為 50 ℃時(shí),基線噪音減小,基線平穩(wěn),具有較好的重現(xiàn)性.所以,色譜柱最終溫度選擇 50 ℃.

    2.5 流速的選擇

    流速是影響目標(biāo)物峰型和保留時(shí)間的重要因素之一.隨著流速的增大,目標(biāo)物的出峰時(shí)間提前,峰型變得尖銳;但是流速過大容易造成柱壓過高,影響峰型,縮短色譜柱的使用壽命.實(shí)驗(yàn)在 0.8 ~ 1.8 mL/min 范圍內(nèi)對流速進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果如圖3所示.

    圖3 不同流速下的維生素D3色譜圖Fig.3 Chromatogram of vitamin D3 with different flow velocities

    當(dāng)流速為1.8 mL/min、1.5 mL/min和1.2 mL/min 時(shí),維生素D3的保留時(shí)間小于1 min,出峰時(shí)間過早,在檢測樣品時(shí)容易與雜質(zhì)一起出峰,對樣品中維生素D3含量的精確度造成干擾;當(dāng)流速為0.8 mL/min 時(shí),維生素D3的色譜峰過寬.綜上所述,選擇1 mL/min為最佳流速.

    2.6 方法學(xué)考察

    2.6.1 線性、檢出限及定量限

    選取500 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L和1 mg/L的維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作液,按照優(yōu)化好的最佳色譜條件進(jìn)行測定,繪制樣品質(zhì)量濃度(x,mg/L) 與峰面積(y,mV ·s) 標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸分析,結(jié)果如表3 所示.該方法在5 ~ 200 mg/L 時(shí)線性關(guān)系良好.檢出限、定量限如表3 所示.

    表3 維生素D3的線性回歸方程、線性范圍、 檢出限、定量限Table 3 Linerregression,liner range,LOD,LOQ of vitamin D3

    2.6.2 回收率和精密度

    稱取1.0 g的魚肝油樣品于離心管中,分別加入5 mg/kg、10 mg/kg,50 mg/kg的維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作液,靜置一段時(shí)間后,樣品經(jīng)正己烷提取,過膜上機(jī),在上述優(yōu)化好的色譜條件下進(jìn)樣檢測,計(jì)算其加標(biāo)回收率.低、中、高3個加標(biāo)水平分別重復(fù)測定6次,結(jié)果如表4.維生素D3在3個加標(biāo)水平中回收率分別為87.4 %、90.7 %和89.3 % ,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 為 3.2 %、1.0 %、0.3 %.

    表4 回收率及精密度Table 4 Recovery and precision

    2.6.3 實(shí)際樣品檢測

    對6個不同品牌的魚肝油樣品進(jìn)行分析,檢測結(jié)果見表5. 由表5的結(jié)果顯示: 不同品牌的魚肝油中維生素D3的含量不同,這可能與魚肝油原料的來源、處理、加工工藝等因素有關(guān).

    表5 不同品牌魚肝油中維生素D3的含量Table 5 Content of six kinds of Cod Liver Oil and vitamin D3

    3 結(jié) 論

    建立了超高效合相色譜(UPC2) 對魚肝油中維生素D3的檢測方法,考查了色譜柱、助溶劑、系統(tǒng)背壓、色譜柱溫度、流速等因素,選定了最佳實(shí)驗(yàn)條件.該方法分析時(shí)間短,維生素D3在2 min出峰完全,實(shí)驗(yàn)步驟簡單,安全環(huán)保,為魚肝油中維生素D3的檢測提供了技術(shù)支持,為魚肝油的質(zhì)量評價(jià)提供新方法.

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