基于g-C3N4-CeO2復(fù)合材料的電化學(xué)生物傳感器

李曉琴， 劉雅杰， 曹秀芝， 王 娟, 姚 慧

(沈陽化工大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

過氧化氫(H2O2)不僅是酶反應(yīng)的產(chǎn)物，還是許多工業(yè)生產(chǎn)的原材料,在工業(yè)、環(huán)保、食品、制藥、臨床和許多其他領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用[1-2].但是過量的H2O2可能會損壞DNA或蛋白質(zhì)導(dǎo)致一些疾病的產(chǎn)生，如癌癥、心血管疾病和帕金森氏病等[3-4].因此對H2O2進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測具有十分重要的意義.目前可用于對H2O2的檢測方法有化學(xué)發(fā)光法、熒光法和電化學(xué)方法等[5-8].其中因方法簡單、靈敏度高、成本低和選擇性好等優(yōu)勢使電化學(xué)方法受到廣泛關(guān)注[9-10].

石墨氮化碳(g-C3N4)是由碳、氮元素以sp2雜化形成的三嗪環(huán)(C3N3環(huán))或3-s-三嗪環(huán)(C6N7環(huán))構(gòu)成，具有類石墨結(jié)構(gòu)的層狀化合物.因其具有高的光催化活性已成為在光催化分解水制氫[11-13]，光催化降解有機(jī)污染物[14-16]和傳感器[17-19]等領(lǐng)域研究的熱點.除了具有光催化活性，g-C3N4還具有良好的生物相容性，低毒，高溫穩(wěn)定性，化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)，制備簡單以及價格低廉等優(yōu)點，這使其在電化學(xué)傳感器方面的應(yīng)用成為可能.但g-C3N4的缺點是導(dǎo)電性差，這也是g-C3N4材料在電化學(xué)傳感器方面報道較少的原因.近年來，唐躍[20]等制備出了石墨相氮化碳，將其修飾到玻碳電極表面用于檢測重金屬Cd2+.黃素珍[21]等制備了基于g-C3N4材料用于硝基苯檢測的電化學(xué)傳感器.為了改善g-C3N4的導(dǎo)電性，以g-C3N4作為基體材料摻雜傳導(dǎo)電子的元素或化合物從而提高基體材料電子的傳遞性被廣泛研究.研究發(fā)現(xiàn)在g-C3N4中摻雜CeO2可形成異質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于電子的傳遞從而為本課題的研究提供了依據(jù)[22].

CeO2是一種應(yīng)用很廣泛的稀土半導(dǎo)體材料，具有獨特的螢石晶體結(jié)構(gòu)和豐富的氧空位缺陷.因其能在Ce4+/Ce3+兩種價態(tài)之間相互轉(zhuǎn)化，從而具有良好的氧化還原能力[23].CeO2已被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)、光學(xué)、催化劑、氣體傳感器等領(lǐng)域[24].近年的研究表明，納米CeO2性質(zhì)穩(wěn)定，比表面積高，具有良好的生物相容性，這使其在電化學(xué)傳感器方面的應(yīng)用成為可能[25].本文成功合成了g-C3N4-CeO2復(fù)合材料，為了近一步提高材料的導(dǎo)電性在材料表面電化學(xué)聚合金，將其應(yīng)用于H2O2生物傳感器的構(gòu)建.用循環(huán)伏安法和計時電流法研究該傳感器對H2O2的電化學(xué)行，并對實驗條件進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明該生物傳感器有較低的檢出限、較寬的線性范圍和較強(qiáng)的抗干擾能力，可以應(yīng)用于對H2O2的檢測，在實際水樣的測定中得到較滿意的結(jié)果.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電化學(xué)工作站，CHI 660C 型，上海辰華儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)三電極體系：工作電極為修飾后的玻碳電極(GCE)，對電極為鉑絲電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)；高低真空掃描電鏡，JMS-6360LV型，日本電子株式會社；X射線衍射儀，D-8型，德國Bruker公司；FTIR紅外光譜儀，Nicolet 5-DX型，美國賽默飛世爾科技公司.

Ce(NO3)3·6H2O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；辣根過氧化物酶，HRP，Aladdin公司，RZ>2.5；尿素，沈陽市新化試劑廠；過氧化氫，體積分?jǐn)?shù)30 %；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為二次蒸餾水.實驗采用傳統(tǒng)的高錳酸鉀滴定法測定H2O2的準(zhǔn)確濃度.

1.2 g-C3N4-CeO2材料的制備

1.2.1 g-C3N4的制備

稱取10.0 g尿素于研缽中[26]，研磨后倒入坩堝中，將坩堝放于烘箱中在80 ℃的溫度下干燥24 h，之后放于馬弗爐中在550 ℃條件下加熱4 h后可得到黃色粉末.用硝酸和水清洗后在80 ℃的溫度下過夜干燥即得g-C3N4.

1.2.2 g-C3N4-CeO2的制備

參照文獻(xiàn)[22]的合成方法,稱取0.1 g g-C3N4和0.012 6 g Ce(NO3)3·6H2O溶于19 mL水中，在室溫條件下攪拌30 min后再超聲30 min.然后在攪拌的條件下加入0.5 mL NH3·H2O，之后將混合液放在25 mL聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中在160 ℃的條件下加熱12 h,產(chǎn)物用水和乙醇各洗滌離心3次，最后在60 ℃的條件下過夜干燥即得到g-C3N4-CeO2材料.

1.3 g-C3N4-CeO2材料修飾電極的制備

1.3.1 CHIT溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.02 g 殼聚糖(CHIT,脫乙酰度為92 %) 于小燒杯中進(jìn)行溶解,加入10 mL 0.1 mol/L的乙酸,加熱攪拌使其溶解后超聲10 min制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 %的CHIT溶液.

1.3.2 g-C3N4-CeO2-HRP修飾液的制備

準(zhǔn)確稱取0.002 g所制備的 g-C3N4-CeO2材料于小塑料管中，加入300 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 %的CHIT溶液，超聲50 min使其混合均勻，之后加入2 mg 的HRP超聲3 min，即制得 g-C3N4-CeO2-HRP修飾液.

1.3.3 修飾電極的制備

首先將玻碳電極用0.05 μm的α-Al2O3拋光粉在拋光布上拋光至鏡面，然后依次在體積比1∶1硝酸溶液、丙酮和水中各超聲3 min 后用氮氣吹干備用.

取6 μL g-C3N4-CeO2-HRP修飾液滴涂在玻碳電極表面，晾干后把修飾電極放到已配制好的10 mmol/L氯金酸的0.5 mol/L硫酸溶液中，采用計時電流法(恒電位-0.5 V，時間分別是2、4、6、8、10、12 min)進(jìn)行掃描，得到Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE修飾電極.電極在4 ℃冰箱中保存.

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征及分析

2.1.1 SEM表征

圖1為g-C3N4和 g-C3N4-CeO2材料的掃描電鏡圖.從圖1(a)中可以看到g-C3N4的微觀形貌呈顆粒狀，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因是合成的g-C3N4材料團(tuán)聚現(xiàn)象嚴(yán)重.從圖1(b)中可以看出CeO2的引入改變了g-C3N4的表面形貌，與g-C3N4相比，g-C3N4-CeO2材料呈現(xiàn)層狀，在其表面有粉末狀顆粒附著，說明CeO2已成功的摻雜于g-C3N4中.

圖1 g-C3N4 和g-C3N4-CeO2 材料的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 SEM images of g-C3N4 and g-C3N4-CeO2

2.1.2 XRD表征

圖2是g-C3N4和g-C3N4-CeO2的XRD圖，在圖2中a的13.2°和27.8°處出現(xiàn)了兩個g-C3N4的特征峰，對應(yīng)的晶面分別是(100)和(002)，13.2°處的峰與g-C3N4三均三嗪環(huán)的平面堆垛結(jié)構(gòu)相對應(yīng)，27.8°處的峰與芳環(huán)片段的層間堆棧有關(guān)[27].圖2中b在2θ=32.5°、47.9°、56° 處出現(xiàn)了3個衍射峰，分別對應(yīng)CeO2的(200)、(220)、(311)晶面，但是CeO2的(111)晶面卻未被觀察到，這可能是因為CeO2在復(fù)合材料中的量少，也可能是被g-C3N4在(002)處的強(qiáng)峰給覆蓋了[22].

圖2 g-C3N4和g-C3N4-CeO2 的X-射線衍射曲線Fig.2 XRD patterns of g-C3N4 and g-C3N4-CeO2

2.1.3 FTIR表征

圖3為g-C3N4和g-C3N4-CeO2的紅外光譜圖.圖3中a在3 000～3 500 cm-1處出現(xiàn)的峰為N—H的伸縮振動，1 254、1 325、1 420 cm-1是碳氮雜環(huán)的C—N伸縮振動.1 571、1 637 cm-1是C==N的伸縮振動，809 cm-1是三嗪結(jié)構(gòu)的吸收峰[28].圖3中b曲線g-C3N4的所有特征吸收峰都可在g-C3N4-CeO2中找到，說明通過水熱合成后g-C3N4仍能保持其原有的結(jié)構(gòu).在1 087 cm-1處出現(xiàn)了一個弱的吸收峰，這可能是 Ce—O—N的伸縮振動[29]，進(jìn)一步證明了CeO2較好地?fù)诫s到g-C3N4中.

a g-C3N4 b g-C3N4-CeO2圖3 g-C3N4和g-C3N4-CeO2的紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of g-C3N4 and g-C3N4-CeO2

2.2 Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE的電化學(xué)行為

圖4為不同修飾電極在0.1 mol/L的PBS(pH=7.0，v=100 mV/s)溶液中的循環(huán)伏安圖.

a GCE b g-C3N4-CeO2/GCE c g-C3N4-HRP/GCEd g-C3N4-CeO2-HRP/GCE e Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE圖4 不同修飾電極在PBS(0.1 mol/L,pH=7.0) 溶液中的循環(huán)伏安曲線Fig.4 CVs of different modified electrods in PBS(0.1 mmol/L,pH=7.0) solution

圖4中，a為未修飾玻碳電極的循環(huán)伏安曲線，b為只修飾g-C3N4-CeO2的玻碳電極的循環(huán)伏安曲線,可以看出a、b曲線無明顯的氧化還原峰，說明g-C3N4-CeO2在電極表面不發(fā)生電子轉(zhuǎn)移.c、d分別為g-C3N4,g-C3N4-CeO2與HRP共同修飾玻碳電極的循環(huán)伏安曲線，可以看出CeO2的加入有利于電子的傳遞，d曲線在-0.4 V附近出現(xiàn)了HRP的還原峰，表明HRP在電極表面發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移，但可逆性較差.e為電聚合金后修飾電極的循環(huán)伏安曲線，相比于a、b、c、d 曲線，e曲線的響應(yīng)電流增大較多，且還原峰電位正移至-0.3 V，電化學(xué)反應(yīng)的可逆性有所提高，說明納米金的引入加快了電子的轉(zhuǎn)移，有利于HRP的直接電子轉(zhuǎn)移.

2.3 掃速的影響

圖5為不同掃速(20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220 mV/s)下Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE在pH=7.0的PBS緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖.由圖5可以看出：隨著掃速的增加,電流強(qiáng)度也隨之增大,但是氧化峰和還原峰的峰電位幾乎不變,由此可見修飾電極具有較好的電化學(xué)可逆性.還原峰電流(Ipc，μA) 和氧化峰電流(Ipa,μA) 均與掃描速度(v,mV/s)的一次方呈線性關(guān)系(圖5插圖),線性回歸方程分別為Ipc=0.908+0.107v,相關(guān)系數(shù)r=0.997 1;Ipa=-1.125-0.097v,相關(guān)系數(shù)r=-0.999 5,表明該電極反應(yīng)受表面吸附過程控制[30].

1 v=20 mV/s 2 v=40 mV/s 3 v=60 mV/s 4 v=80 mV/s 5 v=100 mV/s 6 v=120 mV/s 7 v=140 mV/s 8 v=160 mV/s 9 v=180 mV/s 10 v=200 mV/s 11 v=220 mV/s圖5 不同掃速下g-C3N4-CeO2-HRP/GCE/Au的 循環(huán)伏安曲線Fig.5 CVs of g-C3N4-CeO2-HRP/GCE/Au with different scan rates

2.4 阻抗的測定

電化學(xué)阻抗(EIS)是一種表征電化學(xué)界面導(dǎo)電性的表征手段,用該方法可以表征電極表面的化學(xué)反應(yīng)過程.如圖6中的a曲線所示，當(dāng)電極沒有被修飾時圖上出現(xiàn)一個半圓形曲線，表明電子的傳遞受到阻礙；當(dāng)電極表面被g-C3N4-CeO2-HRP修飾后,EIS曲線上的半圓弧半徑明顯增大(曲線b),說明g-C3N4-CeO2-HRP成功修飾于電極表面并影響了電子表面的傳遞；當(dāng)在g-C3N4-CeO2-HRP表面再修飾納米Au后(曲線c)，導(dǎo)電性明顯增加，表明修飾納米金后電極具有較好的導(dǎo)電性，促進(jìn)了溶液與電極之間的電子傳遞.

a GCE b g-C3N4-CeO2-HRP/GCE c Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE圖6 不同修飾電極的阻抗譜圖Fig.6 EIS curves of different modified electrods

2.5 實驗條件的優(yōu)化

2.5.1 電化學(xué)聚合氯金酸時間對修飾電極響應(yīng)電流的影響

電化學(xué)聚合氯金酸的時間長短會影響修飾電極響應(yīng)電流的大小，實驗以2、4、6、8、10、12 min作為備選條件.實驗結(jié)果表明：在6 min時電極產(chǎn)生的響應(yīng)電流最大，反應(yīng)最靈敏，因此選用6 min作為實驗的最佳電聚合時間.

2.5.2 工作電位對修飾電極響應(yīng)電流的影響

在-0.25～-0.45 V范圍內(nèi)對響應(yīng)電流值進(jìn)行測定，考察工作電位對修飾電極響應(yīng)電流的影響.結(jié)果表明：電位在-0.25～-0.35 V時響應(yīng)電流隨著電位的減小逐漸增大，電位為-0.35 V時，產(chǎn)生的響應(yīng)電流最大，反應(yīng)最靈敏，電位低于-0.35 V時，響應(yīng)電流逐漸減小.因此實驗選用-0.35 V為該傳感器的最佳工作電位.

2.5.3 pH對修飾電極響應(yīng)電流的影響

pH對電極表面酶的催化活性有很大的影響.在pH為5.0～9.0范圍內(nèi)考察修飾電極在0.1 mol/L PBS緩沖溶液中的響應(yīng)電流的變化.實驗結(jié)果表明:在-0.35 V工作電位下，pH在5.0～7.0范圍內(nèi)，修飾電極的響應(yīng)電流隨著pH的增大而增大；至pH=7.0時，響應(yīng)電流最大，靈敏度最高，當(dāng)pH超過7.0時，響應(yīng)電流呈下降趨勢.因此實驗選擇pH=7.0的PBS溶液做為測試底液.

2.6 Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對H2O2的催化活性研究

圖7為v=100 mV/s時Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE修飾電極對H2O2的電催化響應(yīng)循環(huán)伏安曲線.由圖7可以看出：在沒加入H2O2的空白PBS(0.1 mol/L,pH=7.0)溶液中，電極在0.5～-0.5 V范圍內(nèi)產(chǎn)生了一對準(zhǔn)可逆的氧化還原峰；當(dāng)加入0.1 mmol/L的H2O2后還原峰電流顯著增大，表明Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE修飾電極對H2O2的還原具有明顯的催化作用.

圖7 加入0.1 mmol/L H2O2前后Au/g-C3N4-CeO2- HRP/GCE的循環(huán)伏安曲線Fig.7 CVs response of Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE before and after the absence of 0.1 mmol/L H2O2

2.7 Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對H2O2的檢測范圍及檢出限

在最佳實驗條件c(PBS)=0.1 mol/L,pH=7.0,U=-0.35 V下，Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對H2O2響應(yīng)的計時電流曲線如圖8所示.由圖8可以看出：隨著溶液中H2O2濃度的增加，響應(yīng)電流逐漸增大，且電催化響應(yīng)很快，表明此傳感器對H2O2具有很好的催化效果.結(jié)果表明：Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對H2O2的還原峰電流(I，μA)與其濃度(c,mmol/L)在1.0×10-5～4.6×10-3mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為I=4.254+10.164c，相關(guān)系數(shù)為r=0.998 8，檢出限為2.6 μmol/L(S/N=3).

1 c(H2O2)=0.01 mmol/L 2 c(H2O2)=0.1 mmol/L 3 c(H2O2)=1 mmol/L圖8 Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對不同 濃度H2O2響應(yīng)的計時電流曲線Fig.8 The chronoamperometric curves of Au/g- C3N4-CeO2-HRP/GCE response to different concentrations

2.8 Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和干擾實驗

為考察修飾電極的穩(wěn)定性，將一支Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE置于pH=7.0 的PBS緩沖溶液中，在100 mV/s的掃速下，連續(xù)進(jìn)行40圈循環(huán)伏安掃描.結(jié)果表明：循環(huán)掃描40圈后，其電流響應(yīng)信號仍能保持初始信號的82.1 %，說明電極具有較好的穩(wěn)定性.在相同條件下，用一根Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對1 mmol/L的H2O2重復(fù)測定5次，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.1 %，說明該電極具有較好的重現(xiàn)性.

利用計時電流法對有可能的干擾物進(jìn)行測定.在優(yōu)化實驗條件下，與1 mmol/L H2O2同濃度的谷氨酸，組氨酸，抗壞血酸以及10倍濃度的葡萄糖，檸檬酸，甘氨酸，乳酸，酪氨酸對H2O2的測定均不產(chǎn)生干擾，說明該電極具有較好的選擇性.

2.9 實際樣品測定

為驗證Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE傳感器在實際樣品中測定的可行性，用上述傳感器對自來水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗.取5.0 mL自來水樣品，用5.0 mL PBS(0.1 mol/L,pH=7.0)稀釋后，加入H2O2(忽略體積影響)的濃度分別為0.25,0.5和1 mol/L.分別測定樣品溶液的H2O2濃度，每個濃度樣品測定3次，結(jié)果如表1所示.由表1結(jié)果可知：Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE測定自來水樣品的加標(biāo)回收率可達(dá)98.4 %～101.2 %，因此，該傳感器可以用于實際水樣的檢測.

表1 實際水樣中H2O2的測定Table 1 The determination of H2O2 in real water samples

3 結(jié) 論

采用高溫煅燒法合成g-C3N4材料，以此為基底材料摻雜CeO2制備出g-C3N4-CeO2復(fù)合材料，用殼聚糖將g-C3N4-CeO2復(fù)合材料和HRP修飾到玻碳電極表面，進(jìn)一步電化學(xué)聚合納米金構(gòu)建新型的Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE酶傳感器.該傳感器界面具有良好的生物相容性、導(dǎo)電性和催化活性.該傳感器還具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，對H2O2具有較好的還原效果.該研究對構(gòu)建新型的電化學(xué)酶傳感器在的檢測H2O2方面有潛在的應(yīng)用前景.