通腑瀉肺法對ALI/ARDS大鼠腸屏障的保護(hù)作用*

蘇景深，劉恩順，孫增濤，鄭 莉，趙鑫民，陳善夫

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150；2.天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院，天津 300073；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）作為一種臨床危重癥幾乎涉及各個(gè)學(xué)科，腸道屏障功能在ALI/ARDS發(fā)病過程中起的作用越來越受到人們重視。腸道不僅是諸多危重疾病的靶器官，更是啟動(dòng)者，腸道屏障功能已成為判斷危重患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)[1-2]。中醫(yī)從“肺與大腸相表里”理論出發(fā)，運(yùn)用通腑瀉肺方法治療肺系膿毒血癥在臨床上取得了較好的療效[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，通腑瀉肺中藥能夠降低血清細(xì)胞因子水平，減輕肺組織和全身的炎癥損傷[4]。為此，筆者用脂多糖（LPS）復(fù)制大鼠ALI/ARDS模型，用通腑瀉肺中藥進(jìn)行干預(yù)，探討其對ALI/ARDS大鼠腸屏障的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠27只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXX（京）2012－0001），購入后置中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所實(shí)驗(yàn)中心常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑 通腑瀉肺中藥顆粒劑 (葶藶子、桑白皮、大黃、枳實(shí)、厚樸)，購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥房。通腑瀉肺方用蒸餾水配置，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩４竽c桿菌內(nèi)毒素脂多糖（美國，S igma公司）。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 儀器 去離子水儀，PALL,Purelab Plu。高速離心機(jī)，Centrifuge 5415D，Eppendorf公司。分光光度計(jì)，NANODROP 2000，Therno scientific。渦旋振蕩儀，QL-902，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。轉(zhuǎn)移脫色搖床，TS-8，海門其林貝爾儀器制造公司。

2 方法

2.1 ALI/ARDS模型的建立及分組給藥 動(dòng)物購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字隨機(jī)分為空白對照組、模型組、中藥組，每組9只。模型組與中藥組于左側(cè)尾靜脈注射內(nèi)毒素8 mg/kg，復(fù)制ALI/ARDS模型。正常對照組大鼠靜脈注射生理鹽水。對照組與模型組在造模完成后即用生理鹽水灌服，每次0.01 mL/g。治療組在造模完成后給予通腑瀉肺中藥灌胃，每次0.01 mL/g，每日1次，共7日。

2.2 鏡下觀察 給藥1周后，截取距幽門下15 cm處腸組織，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色檢測。光鏡下觀察，比較分析各組大鼠腸組織病理學(xué)改變。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）法檢測大鼠血血漿D-乳酸及DAO水平 于大鼠腹主動(dòng)脈取血，離心后進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，分別測定血漿中漿D-乳酸、DAO的表達(dá)情況。操作步驟按參照試劑盒說明書進(jìn)行。將檢測結(jié)果用ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線專用軟件分別作出漿D-乳酸、DAO濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各檢測孔中漿D-乳酸及DAO的濃度。

2.4 免疫組化染色方法檢測檢測腸組織NF-κB P65及TLR4蛋白的表達(dá) 將組織切片行脫蠟、水化處理后，高壓修復(fù)抗原，用3%過氧化氫溶液消除內(nèi)源性過氧化酶，血清封閉后各組切片分別加入兔源性核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）P65 及 TLR4 多克隆抗體（均為1∶100稀釋），4℃過夜后加入兔二抗，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺蘭（DAB）顯色，光鏡下觀察。NF-κB P65及TLR4的陽性反應(yīng)產(chǎn)物均呈棕黃色。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野、拍照，代表該動(dòng)物肺組織蛋白表達(dá)強(qiáng)度。應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件分析陽性細(xì)胞數(shù)，同時(shí)將空白組陽性細(xì)胞率設(shè)置為100%，計(jì)算其他組別的陽性細(xì)胞率，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠腸組織病理情況 空白組大鼠腸組織光鏡下可見腸絨毛排列整齊，上皮完整，絨毛局部輕度變矮、增粗，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；部分黏膜下層水腫，部分固有層輕度水腫，部分黏膜層與肌層輕度分離。模型組大鼠腸組織可見腸絨毛局部上皮脫失，絨毛變矮、增粗、融合；黏膜下層廣泛水腫，血管增生、較多炎細(xì)胞浸潤，可見孤立淋巴小結(jié)；固有層較多淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤；黏膜層與肌層廣泛分離。中藥組大鼠腸組織光鏡下可見腸黏膜上皮完整，大部分上皮平坦，局部絨毛變矮、增粗，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；黏膜下層輕度水腫，部分固有層輕度水腫，少量淋巴細(xì)胞浸潤；部分黏膜層與肌層輕度分離，見圖1。

3.2 大鼠血漿D-乳酸及DAO水平 與空白組相比，模型組可見大鼠血漿D-乳酸、DAO含量顯著升高（P<0.05）。與模型組相比,治療組血漿D－乳酸、DAO含量明顯降低（P<0.05），見表1。

3.3 腸組織NF-κBP65及TLR4的表達(dá) 與空白組比較，模型組可見NF-κB P65表達(dá)顯著升高（P<0.05）；中藥組經(jīng)過治療干預(yù)后，NF-κBP65表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白組比較，模型組可見TLR4表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥組經(jīng)過治療干預(yù)后，TLR4表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2、圖3、表2。

表1 各組大鼠血漿D-乳酸、DAO檢測結(jié)果比較（±s）Tab.1 Comparison of test resultsof D-lactateand DAO in plasma of ratsin each group（±s）ng/mL

表1 各組大鼠血漿D-乳酸、DAO檢測結(jié)果比較（±s）Tab.1 Comparison of test resultsof D-lactateand DAO in plasma of ratsin each group（±s）ng/mL

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別 例數(shù) D-乳酸 DAO空白組 9 1210.3±85.4 494.6±98.8模型組 9 2221.0±69.6* 1 208.2±77.5*中藥組 9 1502.9±96.0* 847.2±49.6#

表2 腸組織表達(dá)NF-κB P65及TLR4的平均光密度值（±s）Tab.2 Average density of NF-κB P65 and TLR4 expressed in intestinal tissue（±s）

表2 腸組織表達(dá)NF-κB P65及TLR4的平均光密度值（±s）Tab.2 Average density of NF-κB P65 and TLR4 expressed in intestinal tissue（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別 例數(shù) NF-κb P65 TLR4空白組 9 18.056±1.72 14.38±2.08模型組 9 27.526±2.58* 22.01±2.31*中藥組 9 22.009±1.56# 18.627±2.06*

4 討論

長期以來，人們對腸道功能的認(rèn)識(shí)偏重于腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。對危重患者通常認(rèn)為胃腸功能處于休眠狀態(tài)，忽略了胃腸功能在患者整體病理生理過程中的作用。20世紀(jì)60年代，Ravin等首先提出胃腸道是發(fā)生多器官功能衰竭前無明確感染灶的病人發(fā)生膿毒癥的潛在致病源。20世紀(jì)80年代Border等進(jìn)一步提出腸源膿毒血癥（Gos）的概念。1988年Wilmore等提出了“腸道發(fā)病的中心器官”學(xué)說，腸道屏障功能已引起了人們廣泛而密切的關(guān)注。ALI/ARDS狀態(tài)下，炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生并相互作用,形成網(wǎng)絡(luò)，且不斷循環(huán)促進(jìn)，形成“瀑布樣”反應(yīng),造成腸黏膜損傷加重甚至衰竭，腸道的屏障功能受到削弱或損害,可使大量的細(xì)菌和內(nèi)毒素經(jīng)過門靜脈和腸黏膜淋巴系統(tǒng)侵入循環(huán)，造成腸源性內(nèi)毒素血癥和菌群移位，并在一定條件下激發(fā)細(xì)胞因子和其他炎癥介質(zhì)的連鎖反應(yīng),引起全身器官的損害[5]。已有許多研究證明腸道在全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）、膿毒癥、MODS的連續(xù)發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥引起的肺、腸和腎的上皮功能紊亂，屏障功能和離子運(yùn)輸功能受到影響，從而發(fā)生器官功能障礙，造成死亡[8]。研究表明選擇性腸道去污能抑制SIRS患者內(nèi)毒素和炎癥介質(zhì)的釋放，并能起到較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與保護(hù)腸黏膜屏障功能有關(guān)[9]。

圖1 各組大鼠腸組織病理結(jié)果Fig.1 Intestinal histopathology resultsof ratsin each group

圖2 NF-κB P65在腸組織的表達(dá)Fig.2 Expression of NF-κB P65 in the intestinal tissue

圖3 TLR4在腸組織的表達(dá)Fig.3 Expression of TLR4 in the intestinal tissue

根據(jù)ALI/ARDS臨床表現(xiàn)的呼吸窘迫、發(fā)紺、便秘、腹?jié)M等特點(diǎn)，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)從“肺與大腸相表里”這一體現(xiàn)臟腑相關(guān)的整體觀的理論出發(fā)，將ALI/ARDS病機(jī)特點(diǎn)概括為肺腸同病，治療當(dāng)以通腑瀉肺為法。通腑瀉肺中藥由大黃、枳實(shí)、厚樸、葶藶子、桑白皮組成。方中大黃、厚樸、枳實(shí)，可以輕下熱結(jié)，除滿消痞。葶藶子、桑白皮瀉肺平喘，行水消腫。全方藥簡力專，既能瀉肺平喘，又能通腑瀉熱，肺腸同治。研究發(fā)現(xiàn)大黃和早期腸內(nèi)營養(yǎng)支持治療能改善大鼠腸缺血-再灌注損傷后腸黏膜屏障的影響，減輕血清內(nèi)毒素血癥和細(xì)菌易位[10]。藥理研究證實(shí)[11]大黃能夠改善腸黏膜血流灌注，改善腸黏膜缺血缺氧狀態(tài)，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)恢復(fù),保護(hù)胃腸黏膜屏障。桑白皮丙酮提取物能夠使豚鼠腸系膜毛細(xì)血管交叉數(shù)目明顯增加，改善血流狀態(tài)，增加血流速度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腸組織病理可見腸絨毛變矮、增粗融合，黏膜下層廣泛水腫，炎細(xì)胞浸潤，固有層較多淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤；黏膜層與肌層廣泛分離。通腑瀉肺中藥干預(yù)后的大鼠腸組織病理損傷減輕。模型組大鼠血漿D-乳酸、DAO明顯升高，提示模型組大鼠腸黏膜受到損傷，其通透性增高，腸組織細(xì)胞受損壞死釋放大量DAO入血，血漿DAO活性增高。通腑瀉肺中藥干預(yù)后可降低血漿D-乳酸和DAO，提示運(yùn)用通腑瀉肺法可以減輕ALI/ARDS模型大鼠腸黏膜損傷，對腸屏障具有保護(hù)作用。模型組大鼠腸組織NF-κB P65、TLR4蛋白表達(dá)升高，通腑瀉肺中藥干預(yù)后其表達(dá)顯著降低，提示通腑瀉肺中藥可以抑制TLR4、NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低炎癥反應(yīng)程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通腑瀉肺中藥對ALI/ARDS病理過程中釋放的大量炎性細(xì)胞因子有抑制作用，改善ALI/ARDS時(shí)腸黏膜的缺血缺氧狀態(tài)，增加腸黏膜血流灌注，減輕腸黏膜細(xì)胞損害，降低腸黏膜通透性，對腸黏膜屏障起到保護(hù)作用。但是其作用機(jī)制復(fù)雜，靶點(diǎn)眾多，需要進(jìn)一步深入探索。