環(huán)境激素聯(lián)合冷應(yīng)激建立勃起功能障礙大鼠模型的實驗研究*

劉鳳霞 斯依提·阿木提 阿卜杜熱伊木江·如則 薛志琴張盼盼 馬文靜 毛吾蘭·買買提依明 蔣 萍 阿地力江·伊明**

1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（烏魯木齊 830011）;2. 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室; 3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室

勃起功能障礙（erectile dysfuction, ED）是指陰莖持續(xù) （至少6個月）不能達(dá)到和維持充分的勃起以獲得滿意的性生活[1]。據(jù)文獻(xiàn)報道，全球約有1億多ED患者，40～70歲的男性中，約有52%的男性有不同程度的ED，更因生活節(jié)奏加快、工作壓力變大及環(huán)境污染因素其發(fā)病率呈明顯上升趨勢[2]。目前針對糖尿病、高脂血癥和神經(jīng)損傷等因素引發(fā)的ED基礎(chǔ)研究相對較多，但就環(huán)境應(yīng)激、環(huán)境雌激素對勃起功能影響領(lǐng)域的研究相對較少，尤其是針對復(fù)合因素誘導(dǎo)的ED研究，相關(guān)ED動物模型則更是鮮有報道。故本研究，通過模擬環(huán)境雌激素與冷應(yīng)激建立慢性復(fù)合應(yīng)激大鼠模型，通過勃起功能和交配實驗成功篩選出ED大鼠模型。并通過觀測生物學(xué)體征、行為模式和性功能改變、應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化，對此模型進(jìn)行了系統(tǒng)評價，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、資料

（一）實驗動物

取120只正常雄性SD大鼠（6周齡），20只性成熟雌性大鼠（2月齡），體質(zhì)量（200±10）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

（二）主要實驗儀器

RXZ-436LD型人工氣候箱（寧波江南儀器廠），酶標(biāo)儀（美國BioRad公司）。

（三）主要試劑和藥物

阿樸嗎啡（apomorphine，APO，A4393-250MG，Sigma，美國）；黃體酮（120804，浙江仙琚治藥股份有限公司）；雌二醇（E2，B130613，寧波市三生藥業(yè)有限公司）；大鼠TNF-α ELISA試劑盒（貨號0707170709，RayBio，美國）、大鼠IL-1β ELISA試劑盒（貨號0707170721，RayBio，美國）；大鼠IL-17α ELISA試劑盒（貨號ab214028，abcam，美國）；大鼠糖皮質(zhì)激素（GC）ELISA試劑盒（貨號BPE30607，Lengton，中國）；大鼠睪酮（T）放免試劑盒、大鼠雌二醇（E2）放免試劑盒、大鼠腎上腺素（E）放免試劑盒與大鼠去甲腎上腺素（NE）放免試劑盒均購自北京北方生物所；戊巴比妥納（貨號57-33-0，Sigma，美國 ）廠家；酒精、氯化鈉等常規(guī)試劑及耗材均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

二、方法

（一）環(huán)境雌激素樣飼料的制備

按每1 kg大鼠常規(guī)飼料中加入芫荽籽和菠菜籽各150 g，飼料由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

（二）發(fā)情雌鼠的制備

按照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行發(fā)情雌鼠的制備。

（三）應(yīng)激大鼠模型的建立與ED模型的篩選

取120只經(jīng)勃起實驗和交配實驗證實具有正常性功能的雄性SD大鼠，隨機取20只為正常對照組（N組），余100只為建模組（M組）。大鼠行1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)入實驗，N組大鼠于常規(guī)環(huán)境中飼養(yǎng)[溫度（20±2）℃，濕度55%～65%]，每日給300 g普通飼料。M組置于人工氣候箱中[溫度（7±2）℃，濕度85%～95%]飼養(yǎng)，每日給環(huán)境雌激素樣飼料300 g。動態(tài)觀測生物學(xué)體征與行為模式改變，評價應(yīng)激模型成模情況，并觀測交配能力與勃起功能改變。建模24周時，M組大鼠通過APO陰莖勃起實驗和交配實驗篩選出ED大鼠模型（ED組），未成ED者為復(fù)合應(yīng)激組（S組）。

（四）APO陰莖勃起實驗和交配實驗

根據(jù)文獻(xiàn)[3]進(jìn)行APO陰莖勃起實驗和交配實驗。

（五）曠場實驗

將大鼠分別放入一規(guī)格為100cm×100cm×50cm的醫(yī)用有機板觀察箱中（XR-XZ301，上海欣軟信息科技有限公司），四壁光照強度為200 lx。攝像機記錄大鼠的運動軌跡及狀態(tài)，Noldus（Noldus，美國）軟件分析大鼠在中心區(qū)活動時間及進(jìn)入中心區(qū)的次數(shù)。

（六）血清指標(biāo)檢測

在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)放免試驗室，根據(jù)放免試試盒說明書，對大鼠血精中T、E2、E和NE水平進(jìn)行檢測。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，對大鼠血清中GC、TNF-α、IL-1β和IL-17α進(jìn)行水平檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、應(yīng)激大鼠體質(zhì)量的變化

結(jié)果顯示，在建模第8周、16周和24周，M組大鼠體質(zhì)量和體質(zhì)量增長率均顯著低于N組（P＜0.05，見表1）。

二、應(yīng)激大鼠行為學(xué)變化

與N組比較，M組大鼠倦臥少動，在中心區(qū)活動時間和進(jìn)入中心區(qū)的次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2，P＜0.05）。

三、應(yīng)激大鼠E、NE和GC水平變化

由表3可見，與N組比較，M組大鼠血清中E水平升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；NE水平升高，GC水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

四、應(yīng)激大鼠勃起功能與交配能力的變化

結(jié)果顯示，第8周、第16周和第24周，M組大鼠陰莖勃起次數(shù)、插入次數(shù)和射精次數(shù)均低于N組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表4、表5），且隨著造模時間延長，呈減少趨勢。

表1 建模期間大鼠體質(zhì)量變化（±s）

表1 建模期間大鼠體質(zhì)量變化（±s）

與N組相比，*P＜0.05

體質(zhì)量(g) 體質(zhì)量增長率(%)N組 M組 P值 N組 M組建模前 223.0±1.88 229.2±0.78 0.548 - -第8周 479.2±1.36 403.1±1.67* 0.002 114.9 75.8第16周 631.7±0.64 509.5±1.87* 0.000 31.8 26.4第24周 662.6±2.57 528.7±1.47* 0.000 4.89 3.77

表2 曠場實驗結(jié)果（±s）

表2 曠場實驗結(jié)果（±s）

與N組相比，*P＜0.05

分組 中心區(qū)活動時間(s) 進(jìn)入中心區(qū)次數(shù)N組 27.63±4.65 3.40±0.26 M組 12.86±0.37* 2.12±0.03*

表3 各組大鼠E、NE和GC檢測結(jié)果（±s）

表3 各組大鼠E、NE和GC檢測結(jié)果（±s）

與N組相比，*P＜0.05

分組 E(ng/mL) NE(ng/mL) GC(ng/mL)N組 15.22±2.64 24.29±1.84 19.57±1.11 M組 17.13±1.86 38.77±1.67* 14.21±1.08*

表4 建模期間大鼠勃起次數(shù)的變化（±s）

表4 建模期間大鼠勃起次數(shù)的變化（±s）

與N組相比，*P＜0.05

N組 M組 P值建模前 3.15±0.31 2.89±0.18 0.548第8周 3.00±0.33 1.71±0.12* 0.002第16周 3.70±0.25 1.47±0.13* 0.000第24周 3.50±0.38 0.37±0.03* 0.000

表5 建模期間大鼠插入次數(shù)與射精次數(shù)的變化（±s）

表5 建模期間大鼠插入次數(shù)與射精次數(shù)的變化（±s）

與N組相比，*P＜0.05

射精次數(shù)N組 M組 P值 N組 M組 P值建模前 18.70±1.49 17.74±0.70 0.573 15.20±1.37 15.18±0.71 0.993第8周 16.85±1.35 12.26±0.69* 0.006 14.57±1.04 9.19±0.40* 0.000第16周 15.80±0.97 4.25±0.31* 0.000 13.15±1.01 4.43±0.32* 0.000第24周 16.65±0.91 1.00±0.17* 0.000 14.95±0.96 0.59±0.11* 0.000交配次數(shù)

五、ED大鼠血清E、NE和GC水平的變化

由表6可見，與N組相比，S組大鼠E和GC水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與N組和S組相比，ED組NE水平上升，GC水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表6 各組大鼠E、NE和GC水平的變化（±s）

表6 各組大鼠E、NE和GC水平的變化（±s）

與N組相比，*P＜0.05；與S組相比，#P＜0.05

分組 E(ng/mL) NE(ng/mL) GC(ng/mL)N組 15.22±2.64 24.29±1.84 19.57±1.11 S組 15.94±1.95 32.98±2.00* 17.00±1.20 ED組 19.04±2.03 44.55±3.34*# 11.42±1.55*#

六、ED大鼠血清T和E2變化

由表7可見，與N組比較，S組大鼠血清中T水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），E2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與N組和S組相比，ED組大鼠血清中T水平降低，E2水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表7 各組大鼠血清T和E2的變化（±s）

表7 各組大鼠血清T和E2的變化（±s）

與N組相比，*P＜0.05，與S組相比，#P＜0.05

分組 T(ng/mL) E2(mIU/mL)N組 3.51±0.36 4122±477.8 S組 1.33±0.12* 3905±217.3 ED組 0.93±0.13*# 5154±248.6*#

七、ED大鼠血清中IL-17α、IL-1β和TNF-α水平變化

由表8可見，與N組比較，S組和ED組大鼠血清中IL-17α、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與S組相比，ED組大鼠血清中IL-17α、IL-1β和TNF-α表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表8 各組大鼠血清炎癥因子水平的改變（±s）

表8 各組大鼠血清炎癥因子水平的改變（±s）

與N組相比，*P＜0.05

分組 TNF-α(ng/mL) IL-1β(ng/mL) IL-17α(ng/mL)N組 16.61±0.081 220.7±7.583 6.64±0.45 S組 17.18±0.028* 282.0±7.734* 9.442±1.28*ED組 17.26±0.041* 284.7±22.13* 9.673±1.52*

討 論

ED屬于男性常見疾病，對男性生理和心理影響極大。隨著生活方式的改變，男性工作壓力大、飲食結(jié)構(gòu)改變，多喜空調(diào)制冷環(huán)境和冰箱制冷食物，導(dǎo)致ED發(fā)病率逐年上升。有文獻(xiàn)報道[4]，預(yù)計2025年，全球ED患病人數(shù)將達(dá)到3.22億。流行病學(xué)調(diào)查顯示與ED發(fā)病有關(guān)的因素包括糖尿病、心血管疾病、肥胖、泌尿系統(tǒng)疾病和精神疾病等[4]，該領(lǐng)域的基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究也得到較為深入的開展，但是，關(guān)于環(huán)境激素和冷刺激對男性ED影響的研究較少。本研究，模擬環(huán)境激素聯(lián)合冷應(yīng)激的干預(yù)條件，觀察其對性行為能力和陰莖勃起功能的影響，探索了復(fù)合應(yīng)激ED大鼠模型建立的可行性。

作為對應(yīng)激模型的評價，一般從3個方面進(jìn)行：（1）行為學(xué)上表現(xiàn)出焦慮樣行為，同時體質(zhì)量增長緩慢；（2）下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）激活，E、NE和皮質(zhì)醇水平升高；（3）慢性炎癥水平顯著升高[5]。本研究結(jié)果顯示，在環(huán)境雌激素樣飲食聯(lián)合冷應(yīng)激條件的干預(yù)下，M組大鼠在建模過程中，早期呈現(xiàn)急躁易怒等行為學(xué)改變，腎上腺軸和交感神經(jīng)興奮，但隨著時間的推移，出現(xiàn)倦臥少動、毛發(fā)無光等變化，體質(zhì)量增長較N組顯著減緩。曠場實驗中M組大鼠在中心區(qū)活動時間和進(jìn)入中心區(qū)次數(shù)顯著減少。該結(jié)果顯示，本方法建立的復(fù)合應(yīng)激模型和復(fù)合應(yīng)激ED大鼠模型組從行為學(xué)改變上，均符合應(yīng)激模型的標(biāo)準(zhǔn)。本研究還發(fā)現(xiàn)M組大鼠E水平明顯升高，NE水平較N組顯著性升高，而GC水平顯著下降，提示雌激素樣飲食聯(lián)合冷應(yīng)激能顯著升高大鼠應(yīng)激水平。但關(guān)于GC水平顯著下降可能和長期冷暴露后對HPA軸激素水平的影響有關(guān)[6]。另一實驗結(jié)果顯示，S組和ED組大鼠外周血中TNF-α、IL-1β和IL-17α水平均顯著上升，這可能和慢性應(yīng)激能損傷機體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致血液中炎癥因子顯著上升，同時可見GC水平下調(diào)，而炎癥因子水平上調(diào)，該結(jié)果與國內(nèi)外研究結(jié)果[7,8]得出的結(jié)論一致，亦可能與上述應(yīng)激條件的長期刺激有關(guān)。

本研究中性行為學(xué)與陰莖勃起功能檢測結(jié)果顯示，在雌激素樣飲食聯(lián)合冷應(yīng)激的干預(yù)下，大鼠出現(xiàn)應(yīng)激改變的同時，性行為和陰莖勃起功能顯著減退，并隨造模時間的延長，進(jìn)一步加重，至干預(yù)24周時，共有57只大鼠出現(xiàn)ED，成模率達(dá)56.7%。ED組大鼠血清中NE與GC水平均較N組具有顯著性差異，并和S組之間亦具有顯著性差異，提示其不僅與應(yīng)激相關(guān)，同時也參與到了應(yīng)激性ED的發(fā)生與發(fā)展中。本研究還發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β和IL-17α等炎癥因子在ED的發(fā)生發(fā)展中可能也發(fā)揮著重要的作用，其機制可能與血管事件有著密切聯(lián)系[9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，S組和ED組大鼠T表達(dá)均顯著降低，且ED組大鼠T水平顯著低于S組，而E2在ED組的表達(dá)較N組和S組顯著升高。這可能與雌激素樣飲食聯(lián)合冷應(yīng)激通過影響T的分泌有關(guān)，也可能和制作雌激素樣飼料的菠菜籽、芫荽籽分別富含異黃酮、雌二醇、雌三醇等植物雌激素[10,11]，進(jìn)而導(dǎo)致雌激素的雄激素抵抗作用有關(guān)[12,13]，并促進(jìn)ED的發(fā)生。

綜上所述，運用雌激素樣飲食聯(lián)合冷應(yīng)激復(fù)合干預(yù)法能夠建立慢性復(fù)合應(yīng)激大鼠模型，該模型從體質(zhì)量、行為學(xué)、腎上腺軸變化及炎癥反應(yīng)均具備了應(yīng)激模型的特征，從中篩選出的ED模型有良好的科學(xué)性，并具有ED成模率高的特點；同時，該方法較好地模擬了環(huán)境復(fù)合應(yīng)激因素對性行為能力和陰莖勃起功能損傷并導(dǎo)致ED發(fā)生的慢性病理過程，為研究環(huán)境雌激素和冷應(yīng)激在ED的發(fā)生發(fā)展中的作用機制及相關(guān)藥物的篩選與研究提供了良好的動物模型。ED的致病因素固然很多，本研究模擬臨床，通過環(huán)境雌激素與冷應(yīng)激構(gòu)建復(fù)合因素基礎(chǔ)上探討了復(fù)合應(yīng)激型ED的動物模型，具有重要的科學(xué)意義，下一步將就環(huán)境激素與冷刺激在ED中的獨立致病機制作為研究的重點。