強(qiáng)精片對(duì)弱畸精子癥患者精子ICSI結(jié)局的影響*DNA完整性及

張培海 李俊君 陽(yáng) 方 董 良 俞旭君 常德貴 陳帝昂**

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（四川成都 610072）；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，約15%的育齡期夫婦不能自然生育，男性因素約占1/2，其中70%為弱畸精子癥導(dǎo)致[1]，偏高的精子DNA碎片率（sperm DNA fragmentation index, DFI）和核蛋白不成熟度是重要原因[2,3]。越來(lái)越多的不育夫婦受益于輔助生殖技術(shù)特別是卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）術(shù)前良好的精液質(zhì)量，能夠極大改善ICSI妊娠結(jié)局。本研究以此為切入點(diǎn)，觀察強(qiáng)精片對(duì)弱畸精子癥患者DFI、核蛋白不成熟度、ICSI妊娠結(jié)局的影響，并探討指標(biāo)間的相關(guān)性。

資料與方法

一、一般資料收集

收集2014年6月至2015年12月到我院就診、需行ICSI治療的男性弱畸精子癥患者，女方檢查無(wú)明顯異常；年齡最小者22歲，最大者45歲，平均年齡（33.03±5.54）歲；不育年限1～12年，平均（4.54±2.40）年。隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。通過(guò)基線分析，兩組患者男性年齡、不育年限、女方年齡無(wú)明顯差異，具有可比性。

二、 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1. 病史：夫婦未采用任何避孕措施同居生活1年以上，女方檢查無(wú)異常；

2. 按照《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（WHO 第5版），精子濃度＞15×106/mL，精子總數(shù)＞39×106/一次射精、按嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)檢查，正常精子形態(tài)＜4%，同時(shí)滿足前向運(yùn)動(dòng)（PR）精子百分率＜32%。

三、入選標(biāo)準(zhǔn)

1. 符合診斷為弱畸精子癥者。

2. 了解并簽署知情同意書。

四、排除標(biāo)準(zhǔn)

排除夫妻雙方染色體核型異?；蛏诚导懊谀蛳笛装Y導(dǎo)致的男性不育，女性卵細(xì)胞發(fā)育異常、激素紊亂等導(dǎo)致的不孕不育，由于子宮疾病、排卵障礙等引起的不孕不育，免疫性不育患者和有嚴(yán)重慢性疾病、肝腎疾病患者。

五、試驗(yàn)方法

采用隨機(jī)對(duì)照的方法，將患者分為試驗(yàn)組、對(duì)照組，每組各36例。試驗(yàn)組：ICSI治療前服強(qiáng)精片（院內(nèi)制劑，川藥制字：Z20070621），5片，tid；對(duì)照組：ICSI治療前服維生素C（國(guó)藥準(zhǔn)字：H51022742）0.1g，tid、維生素E（國(guó)藥準(zhǔn)字：H20003539）0.1g，tid；3個(gè)月為1個(gè)療程，1個(gè)療程后觀察ICSI妊娠結(jié)局。

六、 觀察指標(biāo)

1. DFI、精子核蛋白不成熟率 （1）DFI正常參考值：精子DNA碎片率＜15%；（2）核蛋白不成熟率正常參考值：核蛋白不成熟率＜30%。

2. 3個(gè)月后ICSI治療的妊娠結(jié)局 （1）受精率＝受精卵數(shù)／取卵數(shù)×100%；（2）妊娠率＝妊娠周期數(shù)／移植周期數(shù)×100%。

七、統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0及JMP 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。定量數(shù)據(jù)采用（±s）符合正態(tài)分布的成組定量數(shù)據(jù)采用成組t檢驗(yàn)。組間均數(shù)的兩兩比較采用單因素方差分析，方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)。率的比較采用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)性分析用于描述兩兩變量間的相關(guān)關(guān)系。P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

DNA碎片率及核蛋白不成熟率比較一、兩組治療前、后精子

兩組治療前精子DFI均不符合正態(tài)分布，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；精子核蛋白不成熟率均符合正態(tài)分布，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組具有可比性。

試驗(yàn)組治療后精子DFI和精子核蛋白不成熟率與對(duì)照組相比較，均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，表1）。這說(shuō)明通過(guò)強(qiáng)精片、維生素C、維生素E治療后患者精子DNA碎片率及核蛋白不成熟率均有改善，且強(qiáng)精片作用明顯。

表1 兩組治療前和治療后DFI和精子核蛋白不成熟率的比較（±s）

表1 兩組治療前和治療后DFI和精子核蛋白不成熟率的比較（±s）

與對(duì)照組比較, *： P＜0.01

DFI(%) 精子核蛋白不成熟率(%)治療前 治療后 治療前 治療后試驗(yàn)組 36 21.18±7.30 12.62±3.44* 25.61±8.94 21.43±4.70*對(duì)照組 36 18.73±3.75 21.43±4.70 25.28±8.17 22.32±7.61 n

二、ICSI治療后兩組患者受精率和妊娠率比較

ICSI治療后，強(qiáng)精片干預(yù)治療的試驗(yàn)組受精率為68.66%，對(duì)照組受精率為41.31%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）；試驗(yàn)組妊娠率為32.65%，對(duì)照組妊娠率為30.51%，兩組率的比較采用卡方檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組患者ICSI治療后受精率和妊娠率分析

討 論

男性不育癥為男性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)疾病之一，近年來(lái)其發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)。輔助生殖技術(shù)作為不孕不育癥的一種重要治療手段，對(duì)精子質(zhì)量有確切的要求[4]，良好的精液質(zhì)量，包括DNA碎片率低的精子能夠提高精卵結(jié)合能力，改善著床情況，增加優(yōu)質(zhì)胚胎率，降低流產(chǎn)率[1]。其中精子DNA完整性（包括精子DNA碎片率及精子核蛋白不成熟率）作為一種新的精子功能評(píng)價(jià)指標(biāo)受到越來(lái)越多的關(guān)注[6]。引起精子DNA損傷的原因有很多，主要有生殖道炎癥、睪丸部高溫、精索靜脈曲張、吸煙、環(huán)境因素、藥物與放療、化療等。精子DNA損傷的治療應(yīng)針對(duì)病因?qū)ΠY治療并輔以抗氧化藥物[4,6]。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)關(guān)于男性不育癥的論述多集中在“無(wú)嗣”、“無(wú)子”等方面。中醫(yī)認(rèn)為腎藏精，主生殖和發(fā)育。精子的生成依賴于腎的滋養(yǎng)與溫煦，故精子質(zhì)量異常所致男性不育癥與祖國(guó)醫(yī)學(xué)中的腎虛關(guān)系密切。大多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為腎精不足是其基本病機(jī)，與血瘀等病理產(chǎn)物關(guān)系密切。

強(qiáng)精片由人參、當(dāng)歸、枸杞子、菟絲子、淫羊藿、鹿角膠、車前子、益母草、桃仁、丹參等藥物組成，具有補(bǔ)腎填精、活血化瘀的功效，充分體現(xiàn)“陰陽(yáng)氣血并調(diào)、肝腎兼顧；補(bǔ)中有通、補(bǔ)中有清”的特點(diǎn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，補(bǔ)腎填精、活血化瘀可改善睪丸、附睪功能及精子發(fā)生、成熟的微環(huán)境，促使缺陷精子修復(fù)為正常精子[7,8]。我們前期研究表明也證明，強(qiáng)精片可提高精子濃度、活力，能降低精子畸形率和精子頭部畸形率的百分比，增加附睪液唾液酸（SA）含量，降低精子膜甘油-3-磷酰膽堿（GPC）含量[9]，并能顯著改善不育大鼠附睪精子質(zhì)量，提高睪丸附睪器官系數(shù)，增加附睪質(zhì)量和管壁厚度，促進(jìn)損傷附睪上皮恢復(fù)和上皮細(xì)胞的分泌，從而改善附睪精子成熟功能[10,11]。

基礎(chǔ)研究表明，精子DNA完整性的損傷往往是穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)斷裂成單鏈，其中發(fā)生的機(jī)制可能與染色質(zhì)組裝缺陷、凋亡異常、氧化應(yīng)激等有關(guān)系[12]。精子DNA損傷與體外受孕率和胚胎質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)[13]。精子DNA的完整是作為精子發(fā)揮功能的基本條件，當(dāng)精子DNA完整的時(shí)候，核膜能夠正常包裹住其基因團(tuán)塊，一旦精子DNA受到損傷出現(xiàn)斷裂導(dǎo)致碎片產(chǎn)生后，DNA碎片會(huì)逐漸透過(guò)核膜，導(dǎo)致DNA攜帶的遺傳基因信息丟失，與女性卵原核結(jié)合后形成的受精卵基因組學(xué)可能就會(huì)產(chǎn)生異常，進(jìn)而導(dǎo)致生化妊娠、無(wú)胎心、先兆流產(chǎn)、反復(fù)流產(chǎn)等[14]。

本研究顯示，強(qiáng)精片治療后患者精子DNA碎片率及核蛋白不成熟率明顯改善，可能是通過(guò)抗氧化作用降低DFI，清除精液中多余的活性氧自由基而使精液中ROS趨于平衡，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少精子DNA損傷。同時(shí)，試驗(yàn)組、對(duì)照組受精率有明顯改善，說(shuō)明強(qiáng)精片可能通過(guò)改善患者精子頭部的某些與受精相關(guān)的成分。但是強(qiáng)精片與維生素C和維生素E并沒(méi)有顯著改善ICSI的妊娠率，這個(gè)可能因?yàn)楹箅A段的妊娠情況主要是取決于女方的相關(guān)因素，與男性的精子質(zhì)量關(guān)系不大所致。

同樣，前期回顧性研究[15]中，收集不同因素致無(wú)精子癥患者，均采用睪丸活檢取得其精子，無(wú)論是來(lái)自梗阻性或非梗阻性無(wú)精子癥的精子，還是正常大小睪丸或小睪丸的精子，ICSI的受精率有差異，然而ICSI妊娠率無(wú)明顯差異。

目前，中藥治療弱畸精子癥已成為研究熱點(diǎn)。采用強(qiáng)精片治療男性弱畸精子癥有效，能夠明顯降低精子DFI。如果增加ICSI周期數(shù)量，能夠顯著改善ICSI術(shù)后受精率的優(yōu)勢(shì)，為患者及其家屬提供更大的妊娠機(jī)會(huì)。然而，強(qiáng)精片提高ICSI患者的受精率，而患者的妊娠率未見(jiàn)明顯改變，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。