慢性心力衰竭病人血清miR-451a調(diào)控MMP-9的表達(dá)及臨床意義

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慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是臨床常見疾病，是各種心血管疾病惡化的最終結(jié)局，其死亡率高達(dá)50%，且隨著年齡增長，慢性心力衰竭患病率顯著上升。研究表明，心肌重塑是慢性心力衰竭發(fā)生的重要機(jī)制之一[1-2]。在慢性心力衰竭發(fā)病過程中，病人血清中相關(guān)蛋白水平發(fā)生變化，這些變化在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類復(fù)雜的內(nèi)肽酶(鋅依賴性蛋白酶)，其活性異常會影響心肌重塑、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡等過程，在心血管生理和病理中起重要作用，參與心肌細(xì)胞外蛋白質(zhì)合成和降解的調(diào)控[3-4]。目前，對慢性心力衰竭發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究已深入到分子生物學(xué)水平，基因表達(dá)的變化在疾病發(fā)生過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA是長21-25nt的非編碼RNA分子，是重要的基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控機(jī)體多種生物學(xué)功能。研究表明，多種miRNA在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)，參與慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程，且在心肌肥大、心肌凋亡、心肌離子通道改變及心臟功能代謝異常等過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是TargetScan預(yù)測的miR-451a靶基因之一。本研究旨在探討miR-451a與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)在慢性心力衰竭病人中的表達(dá)情況及相關(guān)性，以期為慢性心力衰竭的臨床診斷及治療提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2014年2月—2016年2月確診為慢性心力衰竭的病人80例作為研究組，其中男44例，女36例；年齡44歲～80歲(57.1歲±6.3歲)；美國紐約心臟病學(xué)會(NYHA)分級：Ⅰ級20例，Ⅱ級22例，Ⅲ級26例，Ⅳ級12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病程6個月以上；②心力衰竭癥狀持續(xù)6個月以上；③左室射血分?jǐn)?shù)<45%；④左心室舒張末內(nèi)徑，男55 mm以上，女50 mm以上；⑤病人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心臟瓣膜疾病、急性心包炎，有穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死等心臟疾病；②阻塞性肺疾?。虎郯橛懈?、腎等重要臟器功能障礙；④于近1個月內(nèi)行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)；⑤伴有惡性腫瘤。另選擇來我院體檢的健康成年人80名作為對照組，其中男45名，女35名；年齡41歲～79歲(56.8歲±5.9歲)。兩組年齡、性別等臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-451a水平 清晨采集所有病人空腹靜脈血5 mL，使用qRT-PCR檢測血清中miR-451a表達(dá)水平。將細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)至1×106/mL。使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)從細(xì)胞提取總RNA。使用Reverse Transcription Kit(Takara，日本)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green(Takara)進(jìn)行實時PCR分析。以β-Actin作為內(nèi)參。利用ABI7500系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。用2-ΔΔCT法計算miR-451a相對表達(dá)的倍數(shù)變化。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃15 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。由上海生工進(jìn)行miR-451a及內(nèi)參引物序列的設(shè)計合成工作。miR-451a引物序列，上游引物：5′-AAACCGTTACCATTACTGAGTT- 3′，下游引物： miScript SYBR Green PCRkit Universal Primer；U6引物序列，上游引物：5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定MMP-9的表達(dá)水平 采集晨起空腹靜脈血5 mL，2 000 r/min離心10 min后，分離血清，使用ELISA法檢測血清中MMP-9的表達(dá)水平。ELISA檢測試劑盒購自云南精賽頓生物制劑公司。除空白孔外，將樣品(每孔100 μL)以及不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(每孔100 μL)分別加入孔中，反應(yīng)孔用膠紙密封。37 ℃溫育90 min后，將板洗滌4次～6次，干燥。除空白孔外，所有其他孔與生物素抗體(每孔100 μL)混合，37 ℃反應(yīng)30 min。將板洗滌4次后，進(jìn)行避光孵育20 min。之后，每個孔依次加入100 μL終止反應(yīng)液混合以結(jié)束反應(yīng)。將反應(yīng)板放入酶標(biāo)儀(BioTek Instruments，Burlington，VT)中，測量OD450值。根據(jù)樣品的OD值對MMP-9含量進(jìn)行計數(shù)，然后乘以樣品的稀釋比，獲得樣品MMP-9的實際含量。將平均值作為相對數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 兩組miR-451a與MMP-9表達(dá)水平比較 與對照組比較，研究組miR-451a表達(dá)水平顯著降低，而血清MMP-9表達(dá)水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組miR-451a與MMP-9表達(dá)水平比較(±s)

2.2 不同NYHA分級miR-451a、MMP-9表達(dá)情況 不同NYHA分級miR-451a和MMP-9表達(dá)水平不同，隨著NYHA分級的進(jìn)展，miR-451a表達(dá)下降，而MMP-9表達(dá)水平上升，不同NYHA分級間miR-451a、MMP-9差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、圖2。

圖1 不同NYHA分級miR-451a表達(dá)水平

圖2 不同NYHA分級MMP-9表達(dá)水平

2.3 血清miR-451a與MMP-9表達(dá)水平的相關(guān)性 線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，隨著miR-451a表達(dá)水平的降低，MMP-9表達(dá)水平逐漸增加，miR-451a與MMP-9的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.702，P<0.05)。詳見圖3。

圖3 血清miR-451a與MMP-9表達(dá)的直線相關(guān)分析圖

3 討 論

慢性心力衰竭作為各種心血管疾病最嚴(yán)重的階段，其發(fā)病率及死亡率極高，且近年來其發(fā)病率持續(xù)增長。在國外人群中心力衰竭的患病率為1.5%～2.0%，在我國人群中患病率為0.9%[6]。慢性心力衰竭是一種進(jìn)行性病變過程，其發(fā)生的基本機(jī)制是心肌重塑。病理性心肌細(xì)胞肥大、心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞外基質(zhì)過度纖維化或過度降解等都是心肌重塑過程的典型特征。

MMPs被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)周圍的標(biāo)志物，可以降解大量的鋅依賴性蛋白質(zhì)，從而降解廣譜的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，包括膠原蛋白[7]。在腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移和血管內(nèi)膜增生等組織重塑過程中均觀察到MMPs表達(dá)的增加。心肌重塑過程是膠原蛋白、糖蛋白等大分子物質(zhì)參與的復(fù)雜過程，在維持心臟正常結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用。已有研究報道，MMPs及其內(nèi)源性組織抑制劑(TIMPs)在介導(dǎo)心肌纖維化和心肌重塑過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，MMPs和TIMPs的循環(huán)水平是心肌重塑和心力衰竭的潛在生物標(biāo)志物[8-9]。在轉(zhuǎn)基因小鼠和充血性心力衰竭動物模型中觀察到MMP-2和MMP-9活性與左心室重塑相關(guān)[10-12]。而MMP-9基因的靶向缺失可抑制急性和左心室壓力超負(fù)荷心力衰竭小鼠模型中的心肌重塑[13-14]。在小鼠慢性心力衰竭模型中發(fā)現(xiàn)，心臟功能受損與內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，MMP-9的活化在與內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)的心室重塑中起主要作用[15]。另有研究表明，心力衰竭病人心肌組織蛋白表達(dá)水平高于正常人，且隨著心功能惡化，MMP-9含量逐漸升高[16]。動物研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭造模兔血清MMP-9濃度高于假手術(shù)組[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭病人血清MMP-9水平高于健康對照組，且不同NYHA分級的慢性心力衰竭病人MMP-9表達(dá)水平不同，隨著心力衰竭程度的增加及病情的進(jìn)展，MMP-9表達(dá)水平呈上升趨勢，提示MMP-9在慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展及病情演變過程中起著重要作用。

miRNA是長21-25nt的非編碼RNA分子，其通過靶向結(jié)合mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)來抑制轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)。miRNA可結(jié)合mRNA的部分互補(bǔ)識別序列，隨后引起mRNA降解可翻譯抑制，從而有效沉默其靶基因[18-20]。生物信息學(xué)研究表明，三分之一的已知基因可能被miRNA調(diào)控。許多研究已報道m(xù)iRNA參與許多重要的細(xì)胞過程，如細(xì)胞凋亡、分化、增殖、腫瘤發(fā)生及抑制等[21]。已有研究證明，多種miRNA參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程，并參與調(diào)控心肌肥大、心肌凋亡、心肌纖維化等過程。病理性心肌肥大通過影響心臟舒縮功能而引起心功能障礙，是發(fā)生心力衰竭的原因之一。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-208能夠降低甲狀腺激素相關(guān)蛋白1和肌肉生長抑制因子的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌生長，引起心肌肥大[22]。另有研究表明，miR-1可通過抑制心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2和心肌轉(zhuǎn)錄因子4的表達(dá)，并通過調(diào)控鈣-鈣調(diào)蛋白信號通路調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長，從而抑制心肌肥大[23]。miR-133a通過直接與活化T細(xì)胞核因子c4的3′-UTR結(jié)合，使其表達(dá)下調(diào)而抑制心肌肥大[24]。體內(nèi)和體外研究表明，miR-1和miR-206通過協(xié)同作用共同調(diào)節(jié)MAPK信號通路調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的熱休克蛋白HSP的表達(dá)，從而加速心肌細(xì)胞凋亡過程[25]。而miR-133通過抑制半胱氨酸-天冬氨酸蛋白消解酶9的表達(dá)，從而起抗凋亡作用，與miR-1通過相互拮抗調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡[26]。心肌纖維化也是引起心力衰竭的原因之一，其主要是由于成纖細(xì)胞增生和心肌間質(zhì)纖維化會使心肌結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生紊亂，并最終導(dǎo)致心力衰竭。研究表明，心力衰竭時miR-21過表達(dá)，通過抑制ERK/MAPK信號通路活性而調(diào)節(jié)心肌纖維化，從而改善心臟功能[27]。另外，miR-133和miR-30通過直接與調(diào)控纖維化過程的結(jié)締組織生長因子CTGF的3′-UTR結(jié)合，下調(diào)其表達(dá)水平，從而抑制膠原纖維生成[28]。且臨床研究表明，miR-133的兩個表型miR-133a和miR-133b在心臟的心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)，且在慢性心力衰竭病人血清中的表達(dá)水平升高，可能通過調(diào)節(jié)作為心力衰竭獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)的NT-proBNP水平而參與心肌重塑和心臟功能，且隨著病情進(jìn)展，其表達(dá)量逐漸升高[29]。人miR-451a基因位于染色體17q11.2內(nèi)，已有研究表明miR-451可作為多種癌癥如鼻咽癌、肝細(xì)胞癌、膀胱癌等癌癥中的腫瘤抑制因子，且在糖尿病腎病病變中通過調(diào)節(jié)LMP7/NF-κB信號通路影響膜細(xì)胞因子的表達(dá)，從而緩解腎纖維化過程。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，慢性心力衰竭病人血清miR-451a表達(dá)水平顯著降低，且隨著心力衰竭程度的增加，其表達(dá)水平逐漸降低。提示miR-451參與慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展及病情演變過程。

MMP-9表達(dá)水平可以在轉(zhuǎn)錄前和轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究證明MMP-9受到多種miRNA調(diào)節(jié)而參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。如miR-145通過調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)水平而抑制胃癌轉(zhuǎn)移。在大腸癌細(xì)胞中，miR-21通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控PTEN/AKT/PI3K/mTOR信號通路活化而改變MMP-9的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的遷移和浸潤[30]。在動脈粥樣硬化性腦梗死中，MMP-9單核苷酸多態(tài)性受miR-491介導(dǎo)的多態(tài)調(diào)控機(jī)制的精細(xì)調(diào)節(jié)作用，而導(dǎo)致MMP-9表達(dá)水平發(fā)生變化。有研究表明，2型糖尿病模型大鼠心肌組織中miR-29b表達(dá)水平的上調(diào)抑制了MMP-9的表達(dá)，從而減少心肌纖維化[31]。另外，在非瓣膜性心房顫動病人中，miR-29b與MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，參與心房顫動病人心肌重塑的病理過程[32]。MMP-9是TargetScan預(yù)測的miR-451a靶基因之一。本研究對miR-451a與MMP-9的表達(dá)水平進(jìn)行線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，隨著miR-451a表達(dá)水平的降低，MMP-9表達(dá)水平逐漸增加，慢性心力衰竭病人血清miR-451a與MMP-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示miR-451a與MMP-9可能具有負(fù)向反饋抑制作用，miR-451a至少部分通過調(diào)控MMP-9表達(dá)而在慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展及病情演變過程中起作用。

綜上所述，慢性心力衰竭病人血清miR-451a水平顯著降低，而MMP-9水平顯著升高，不同NYHA分級慢性心力衰竭病人MMP-9和miR-451a的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，隨著心力衰竭程度的增加，血清miR-451表達(dá)水平逐漸下降，而MMP-9表達(dá)水平逐漸上升，二者存在明顯負(fù)相關(guān)性，提示miR-451a至少部分通過調(diào)控MMP-9表達(dá)而在慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展及病情演變過程中起作用。而慢性心力衰竭過程中miR-451a對MMP-9調(diào)控作用的分子機(jī)制及所涉及的信號通路尚不明確，需要更多研究來進(jìn)一步證實。