基于Biolog—ECO技術(shù)的淮南采煤沉陷區(qū)水體微生物代謝多樣性研究

柳炳俊

摘 要：如何治理與利用高潛水位采煤沉陷區(qū)水資源，一直是困擾區(qū)域生態(tài)文明構(gòu)建與經(jīng)濟(jì)協(xié)調(diào)發(fā)展的1個(gè)重要難題。該研究以我國(guó)東部典型采煤沉陷區(qū)——淮南礦區(qū)為例，通過(guò)Biolog-ECO平板技術(shù)分析3個(gè)不同區(qū)域9個(gè)沉陷水體微生物的碳代謝多樣性特征。結(jié)果表明，3個(gè)區(qū)域水體中異養(yǎng)菌數(shù)量、微生物代謝活性和香濃多樣性指數(shù)均為潘集區(qū)>八公山區(qū)>鳳臺(tái)區(qū)。

關(guān)鍵詞：高潛水位；采煤沉陷區(qū)；Biolog-ECO平板；微生物代謝活性；多樣性指數(shù)

中圖分類號(hào) X52 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）19-0101-04

The Study on Metabolic Diversity of Water Microbial Communities in Huainan Coal Mining Subsidence Area based on Biolog-ECO Plates

LiuBingjun

（Anhui University，Hefei 23000，China；National Engineering Research Center for Coal Gas，Huainan 232001，China）

Abstract：How to manage and utilize water resources in coal mining subsidence areas with high phreatic level has always been an important problem that plagues the coordinated development of regional ecological and economic civilization. As Huainan mining area was the typical coal mining subsidence area in eastern China，carbon metabolism diversity of water microbes in nine subsidence areas in three different regions was investigated by Biolog-ECO plate technique. The number of heterotrophic bacteria，microbial metabolic activity and Shannon diversity index of the three regions were showed Panji >Bagongshan >Fengtai. This study aims to provide theoretical support for the rational planning and utilization of water resources in typical subsidence areas.

Keywords：High phreatic level；Coal mining subsidence area；Biolog-ECO plates；Microbial metabolic activity；Shannon diversity index

煤炭在我國(guó)的能源發(fā)展中一直占有極其重要的戰(zhàn)略地位，在我國(guó)能源消費(fèi)占比超過(guò)60%，其中2016年為62.3%?；茨系V區(qū)作為中國(guó)新型能源基地，是全國(guó)13個(gè)億噸級(jí)煤炭基地之一，煤炭探明儲(chǔ)量約為153億t，開(kāi)采工藝采用多煤層綜合機(jī)械化采煤。這種開(kāi)采方式必然引發(fā)地表沉陷，研究表明淮南采煤沉陷系數(shù)約為0.7[1]?；茨现苓叺乇硭蛋l(fā)達(dá)，有淮河干流與茨淮新河、潁河、西淝河、架河、泥河等眾多支流。此外，淮南地區(qū)地下潛水位高，沉陷超過(guò)1m就常年積水，截至2016年底，淮南采煤沉陷區(qū)面積超過(guò)2.41萬(wàn)hm2，常年積水面積達(dá)0.90萬(wàn)hm2。如此連片的大面積水資源，如能將沉陷區(qū)環(huán)境治理與生態(tài)功能區(qū)建設(shè)結(jié)合起來(lái)，加以合理規(guī)劃利用，勢(shì)必對(duì)區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展、生態(tài)環(huán)境治理，提供強(qiáng)大推助力。

Biolog方法是由美國(guó)的BIOLOG公司于1989年研制成功，最初用于微生物菌種鑒定的一種便捷的方法。它是根據(jù)微生物對(duì)碳源的利用能力差異，來(lái)描述群落中微生物的動(dòng)態(tài)變化。其原理是發(fā)生在微生物利用碳源過(guò)程中產(chǎn)生的自由電子與四唑鹽染料發(fā)生的還原顯色反應(yīng)，其顏色的深淺可以反映微生物對(duì)不同碳源的利用程度[2]。該方法借助于96孔微孔板，如革蘭氏陽(yáng)性板（GP）革蘭氏陰性板（GN）和生態(tài)板（ECO）等來(lái)實(shí)現(xiàn)。

Biolog-ECO微平板法通過(guò)采用底物誘導(dǎo)下的代謝響應(yīng)模式來(lái)測(cè)算水體微生物群落代謝功能多樣性，并用來(lái)描述不同區(qū)域微生物群落功能的差異[3]，吸光值平均變化率（AWCD）用于評(píng)價(jià)水體微生物群落對(duì)碳源利用的整體情況及代謝活性，Shannon多樣指數(shù)用于評(píng)估微生物群落中物種的豐富度。因此Biolog-ECO平板技術(shù)可用于水體“原位”微生物群落代謝和功能多樣性的研究（Garland and Mills[4]，1991；鄭華等[5]，2004；陳喜蓉等[6]，2017）。本研究首次采用Biolog-ECO平板技術(shù)對(duì)我國(guó)典型采煤沉陷區(qū)水體微生物群落代謝功能進(jìn)行多樣性調(diào)查分析，其研究成果將為沉陷區(qū)生態(tài)修復(fù)，水資源利用方向，打造淮南水域生態(tài)功能區(qū)提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣布點(diǎn) 淮南采煤沉陷區(qū)根據(jù)沉陷類型主要?jiǎng)澐譃?大區(qū)域：鳳臺(tái)區(qū)（非穩(wěn)沉區(qū)）、八公山區(qū)（穩(wěn)沉區(qū)）和潘集區(qū)（半穩(wěn)沉區(qū)）。每個(gè)區(qū)選擇3個(gè)有代表的采煤沉陷水域采集水樣，每個(gè)沉陷水域用采水器（1L）采集3個(gè)不同點(diǎn)位，混勻后置于1L無(wú)菌塑料瓶中，冰袋保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，24h內(nèi)檢測(cè)結(jié)束，水質(zhì)數(shù)據(jù)具體詳見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 哈希溶解氧儀5500、哈希DR6000 紫外分光光度計(jì)、3洋MKR-352生化恒溫培養(yǎng)箱、3洋MLS-375L-PC高壓蒸汽滅菌器、Biolog Gen Ⅲ MicroStationTM 自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)。

1.3 平板菌落計(jì)數(shù) 異養(yǎng)菌數(shù)量的測(cè)定采用MPN法，培養(yǎng)基為CM232水瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），將涂布好的平行平板在28℃下培養(yǎng)48h，對(duì)單克隆總數(shù)在30～300的平板進(jìn)行有效計(jì)數(shù)，并以計(jì)數(shù)平板上的單克隆總數(shù)作為0.1mL稀釋樣品中的異養(yǎng)菌總數(shù)。

1.4 Biolog-ECO法 本實(shí)驗(yàn)采用31種碳源底物的Biolog-ECO板（Biolog Inc. Hayward，CA，USA）分析水體微生物群落的碳代謝特征，即代謝功能多樣性。根據(jù)底物的化學(xué)官能團(tuán)及微生物代謝途徑可將31種碳源劃分為6大類[7]，其中聚合物4種、碳水化合物10種、羧酸類7種、氨基酸類6種、酚類2種、胺類2種。實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[8]的方法并略作修改，具體操作步驟如下：將樣品混勻震蕩?kù)o置10min，取5mL原水樣置于95mL無(wú)菌生理鹽水稀釋至10-1梯度，將稀釋后的水樣置于無(wú)菌加樣槽中，用8道移液器將水樣加入平板的微孔中，每孔150μL。每塊板設(shè)3個(gè)重復(fù)。微板加蓋，28℃恒溫培養(yǎng)7d，并于0、24、48、72、96、120、144、168h的時(shí)間點(diǎn)在590nm和750nm下測(cè)吸光度值，其中數(shù)值小于0.06時(shí)按0處理。

1.5 微生物代謝活性指標(biāo)的計(jì)算 以顏色平均變化率（Average Well Color Development，AWCD）評(píng)判微生物群落對(duì)碳源的利用率，并以此指示群落的代謝活性。計(jì)算公式[9]如下：

AWCD=Σ[（Ci-R）590-（Ci-R）750]/n

式中：Ci為所測(cè)定的第i個(gè)碳源孔的光密度值；R為對(duì)照孔的光密度值；n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)。

參考閆法軍等[10]的方法，采用Biolog-ECO微平板培養(yǎng)72h的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以Shannon指數(shù)計(jì)算群落代謝功能多樣性，其算式為：H=-ΣPilnPi。式中：Pi=ni/N；ni為第i種碳源孔的實(shí)際光密度值；N為樣品中所有碳源孔實(shí)際光密度值的總和。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法 采用SPSS17.0單因子方差分析（ one-way ANOVA）確定不同沉陷水體微生物群落碳代謝特征是否有顯著差異（α=0.05）。對(duì)不同微生物群落指標(biāo)與水質(zhì)的相關(guān)性分析采用Pearson分析法，通過(guò)其相關(guān)系數(shù)進(jìn)行判定，數(shù)據(jù)的顯著性水平設(shè)為p<0.05和p<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同沉陷水體異養(yǎng)菌數(shù)量變化 圖1反映出不同沉陷水體異養(yǎng)菌數(shù)量變化。鳳臺(tái)區(qū)水域異養(yǎng)菌數(shù)量顯著低于其他2區(qū)（p<0.05），細(xì)菌數(shù)量變化在（6.2±0.48）×103～（7.0±0.15）×103cfu/mL。八公山區(qū)水域異養(yǎng)菌數(shù)量變化在（7.0±0.74）×103～（9.6±0.38）×103cfu/mL。潘集區(qū)異養(yǎng)菌數(shù)量顯著高于上2個(gè)區(qū)域，且3個(gè)水域之間差異明顯（p<0.05）。

2.2 不同沉陷水體微生物平均吸光值（AWCD）變化特征 水體微生物AWCD隨時(shí)間的變化可以用來(lái)表示群落的代謝平均活性，能直觀的體現(xiàn)微生物群落反應(yīng)速度和最終達(dá)到的程度[10]。9個(gè)水體（潘集區(qū)、八公山區(qū)、鳳臺(tái)區(qū)）AWCD值隨培養(yǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)變化曲線見(jiàn)圖1，從圖1可以看出，所有水體微生物總體變化趨勢(shì)為：12h內(nèi)水體微生物碳代謝活性較低，24h以后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)微生物活性逐步增加，至144h后微生物活性達(dá)到最高后趨于平穩(wěn)。水體微生物AWCD的動(dòng)態(tài)變化范圍為（0.2911±0.004）～（1.1529±0.041），其中潘一礦沉陷區(qū)AWCD最高為1.1529±0.041，張北礦最低為0.29110±0.004。對(duì)比不同水體微生物活性強(qiáng)弱可以明顯看出潘一礦沉陷區(qū)AWCD明顯高于其他區(qū)域（p<0.05）；而張北礦沉陷區(qū)最低，顧橋礦，顧北礦顯著高于張北礦沉陷區(qū)（p<0.05）；其他5個(gè)沉陷區(qū)差異不顯著（p>0.05）。

2.3 不同沉陷水體微生物群落的代謝功能多樣性變化

根據(jù)Biolog-ECO板培養(yǎng)72h的AWCD值計(jì)算Shannon-Wiener指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。菌群多樣性變化特征與碳代謝活性AWCD相似，水體微生物多樣性最低的沉陷區(qū)依次是張北礦、顧橋礦、顧北礦沉陷區(qū)，分別為2.34±0.05、2.94±0.01、3.24±0.01，而潘一礦沉陷區(qū)群落多樣性最高為3.64±0.003，其他5個(gè)區(qū)域差異不顯著（p<0.05）。

2.4 不同沉陷水體微生物群落代謝活性和多樣性與水質(zhì)的關(guān)系 如表2所示，異養(yǎng)菌數(shù)量與溶解氧（DO）成負(fù)相關(guān)關(guān)系（p<0.01），與生物需氧量（BOD5）、化學(xué)需氧量（CODcr）、總磷（TP）成正相關(guān)關(guān)系。水體微生物群落代謝活性與水中溶解氧（DO）在p<0.01水平上成負(fù)相關(guān)關(guān)系r=-0.880，與生物需氧量（BOD5）在p<0.01水平成正相關(guān)關(guān)系，r=0.883，與化學(xué)需氧量（CODcr）在p<0.05水平上成正相關(guān)關(guān)系，r=0.690，與水體PH、總氮（TN）、總磷（TP）相關(guān)關(guān)系不顯著。水體微生物多樣性與水中溶解氧（DO）成負(fù)相關(guān)關(guān)系（p<0.05），r=-0.744，與生物需氧量（BOD5）成正相關(guān)關(guān)系（p<0.05），r=0.690，與CODcr、TP、TN顯著關(guān)系較弱。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，水體中微生物群落與水質(zhì)具有密切關(guān)系。之前許多研究者從水中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量、群落中優(yōu)勢(shì)菌組成情況進(jìn)行分析[11-12]，本研究以微生物群落代謝活性、代謝功能多樣性與不同種類的水質(zhì)主要指標(biāo)為切入點(diǎn)，通過(guò)系統(tǒng)的對(duì)比、分析，更全面地闡明了彼此的相關(guān)性。

潘一礦沉陷區(qū)水體微生物碳代謝活性和群落多樣性指數(shù)都高于其他沉陷水域，這一現(xiàn)象通過(guò)上述數(shù)據(jù)與水質(zhì)關(guān)系分析得到了解釋：潘一礦沉陷區(qū)受生活污水匯入和圍網(wǎng)養(yǎng)殖等因素影響，水中有機(jī)物質(zhì)較高，測(cè)得水域生物需氧量（BOD5）與化學(xué)需氧量（CODcr）均較其他沉陷區(qū)高，微生物代謝活性和多樣性也明顯高于其他水體。夏耕等[13]研究表明溶解氧在6.0mg/L以上、pH值成弱堿性的水質(zhì)條件下，草魚和大口黑能較好生長(zhǎng)，且養(yǎng)殖期間病害較低。潘一礦沉陷水域異養(yǎng)菌數(shù)量、生物需氧量（BOD5）與化學(xué)需氧量（CODcr）等水質(zhì)指標(biāo)處于養(yǎng)殖用水所需指標(biāo)正常范圍內(nèi)。潘集采煤沉陷區(qū)可根據(jù)水質(zhì)條件，利用微生態(tài)菌劑和浮游藻類等手段優(yōu)化水環(huán)境，發(fā)展綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。

不同沉陷區(qū)之間比較，以張北礦、顧橋礦、顧北礦為代表的鳳臺(tái)區(qū)水域微生物碳代謝活性和群落多樣性指數(shù)較其他區(qū)域低，通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析和現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鳳臺(tái)區(qū)沉陷水體農(nóng)業(yè)點(diǎn)源、面源污染較少，又遠(yuǎn)離生活區(qū)，水體有機(jī)物較少致使微生物數(shù)量和多樣性較其他區(qū)域低。比較有趣的發(fā)現(xiàn)是溶解氧（DO）與微生物碳代謝活性和群落多樣性成負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與之前曹煜成、楊鶯鶯[14]等的研究結(jié)果稍有不同，曹煜成等研究結(jié)果表明溶解氧與微生物群里關(guān)系相關(guān)系不大。這很可能是因?yàn)檠芯康乃w環(huán)境不同造成的，前者研究的是羅非魚混養(yǎng)池塘水體微生物群落代謝活性的動(dòng)態(tài)變化及其與水質(zhì)的關(guān)系，而本研究對(duì)采煤沉陷區(qū)大水域作為研究對(duì)象，沉陷水體為開(kāi)放水域、與外部河流相通。本研究發(fā)現(xiàn)溶解氧（DO）與微生物碳代謝活性和群落多樣性成負(fù)相關(guān)關(guān)系，可以從側(cè)面推斷淮南采煤沉陷區(qū)水體中微生物厭氧菌或者兼性厭氧菌占有很大的比例。

4 結(jié)論與展望

本研究首次通過(guò)Biolog-ECO平板技術(shù)研究我國(guó)典型采煤沉陷水域微生物碳代謝活性和群落多樣性特征。研究結(jié)果顯示，不同沉陷水體微生物代謝活性和多樣性存在差異，具體表現(xiàn)以潘一礦、潘一東礦和潘3礦為代表的潘集采煤沉陷區(qū)微生物代謝活性和多樣性最高，以張北礦、顧橋礦和顧北礦為代表的鳳臺(tái)采煤沉陷區(qū)最低，八公山采煤沉陷區(qū)居中。水體微生物代謝活性和菌群多樣性與部分水質(zhì)有顯著相關(guān)關(guān)系，其中與BOD5和CODcr成正相關(guān)關(guān)系，與DO成負(fù)相關(guān)關(guān)系。

本研究結(jié)果能夠?yàn)椴擅撼料菟w治理與利用提供數(shù)據(jù)支持，筆者認(rèn)為利用微生物降解水體中過(guò)多的有機(jī)物、重金屬和代謝產(chǎn)物等，能夠達(dá)到凈化水質(zhì)和水環(huán)境原位修復(fù)的效果，能夠減少人為擾動(dòng)對(duì)沉陷水域環(huán)境的負(fù)面影響。后期在建立以沉陷水體水質(zhì)凈化和水環(huán)境原位修復(fù)的過(guò)程中，一方面潘集區(qū)水域由于水體較其他區(qū)域肥，可以發(fā)展綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)；而鳳臺(tái)區(qū)沉陷水體水質(zhì)條件較好，可以作為水源地加以保護(hù)；八公山區(qū)可以依托當(dāng)?shù)芈糜螛I(yè)，開(kāi)發(fā)生態(tài)濕地公園。另一方面，從水體微生態(tài)角度，還應(yīng)注重篩選具有不同代謝特征的高效菌種或微生態(tài)制劑，優(yōu)化水體微生物群落結(jié)構(gòu)，利用不同種類微生物誘導(dǎo)微生物群落對(duì)環(huán)境中的碳、氮、磷、硫等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行降解與轉(zhuǎn)化，強(qiáng)化微生物群落降解效率與性能，并保持其代謝活性的穩(wěn)定化。因此，高效微生物的篩選與安全性評(píng)價(jià)、微生物群落代謝的特異性誘導(dǎo)、微生物數(shù)量和群落活性穩(wěn)態(tài)化的精準(zhǔn)調(diào)控等將是今后沉降水域微生物的研究方向。

參考文獻(xiàn)

[1]陸垂裕，陸春輝，李慧，等.淮南采煤沉陷區(qū)積水過(guò)程地下水作用機(jī)制[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2015，31（10）：122-131.

[2]李明智，張宇，梅榮武，等.Biolog ECO分析活性污泥微生物功能多樣性特征[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2016，39（06）：55-58.

[3]裴振，孔強(qiáng)，郭篤發(fā).鹽生植被演替對(duì)土壤微生物碳源代謝活性的影響[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2017，37（01）：373-380.

[4]Garland J.L.，Mills A.L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization[J].Appl. Environ. Microbiol，1991，57（8）：2351-2359.

[5]鄭華，歐陽(yáng)志云，方志國(guó)，等.BIOLOG 在土壤微生物群落功能多樣性研究的應(yīng)用[J].土壤學(xué)報(bào)，2004，41（3）：456-461.

[6]陳喜蓉，金映虹，歐濱，等.BIOLOG-ECO基于技術(shù)分析不同林下種植竹蓀地土壤微生物功能多樣性[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017，（36）：370-375.

[7]Choi KH，Dobbs FC.Comparison of two kinds of Biolog microplates（GN and ECO） in their ability to distinguish among aquatic microbial communities[J]. Journal of Microbiological Methods，1999，36：203-213.

[8]Zhan X-Y，Wu D-X，Zhang L，et al. Response of microbial community functional diversity in the rhizosphere of Caragana microphylla to environmental change[J].Acta Ecologica Sinica（生態(tài)學(xué)報(bào)），2010，30（12）：3087-3097 （in Chinese）.

[9]Classen AT，Boyle SI，Haskins KE，et al. Community-level physiological profiles of bacteria and fungi：Platetype and incubation temperature influences on contrasting soils[J]. FEMS Microbiology Ecology，2003，44：319-328.

[10]閆法軍，田向利，董雙林，等.刺參養(yǎng)殖池塘水體微生物群落功能多樣性的季節(jié)變化[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，25（5）：1499-1505.

[11]李志裴，謝駿，王廣軍，等.基于Biolog-ECO技術(shù)分析雜交鱧和大口黑鱸高產(chǎn)池塘水體微生物碳代謝特征[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（1）：185-192.

[12]宋景華，李谷，張世羊，等.養(yǎng)殖池塘水質(zhì)理化因子與微生物群落碳代謝的定量關(guān)系[J].淡水漁業(yè)，2013，43（05）：68-74.

[13]夏耘，王一飛，郁二蒙，等.生態(tài)基對(duì)草魚生長(zhǎng)性能、腸道及水體微生物的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2014，38（09）：1410-1420.

[14]曹煜成，文國(guó)樑，李卓佳，等.池塘水體微生物群落代謝活性的動(dòng)態(tài)變化及其與水質(zhì)的關(guān)系[J].安全與環(huán)境學(xué)報(bào)，2015，15（01）：280-284.

（責(zé)編：張宏民）