氣相色譜-質(zhì)譜研究加味逍遙丸中的揮發(fā)性成分

陳 波 烏日根

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部,呼和浩特,010000)

加味逍遙丸又名丹梔逍遙丸,出自《太平惠民和劑局方》,是在逍遙丸的基礎(chǔ)上加牡丹皮、梔子二味而成。是疏肝解郁,清熱調(diào)經(jīng)的常用方劑,由此制成的中成藥因療效切確、使用簡(jiǎn)便從而在臨床上得到廣泛的使用[1]。因加味逍遙丸龐大的市場(chǎng)基礎(chǔ),故生產(chǎn)廠家眾多。由于復(fù)方的中成藥制劑中,其各個(gè)藥味間相互配伍,藥性及藥物有效化學(xué)成分的相互作用機(jī)制都較為復(fù)雜,故不同的生產(chǎn)企業(yè)和藥品批次之間,其藥物的有效成分及產(chǎn)品質(zhì)量存在一定的差異[2-3]。故而對(duì)中成藥的復(fù)方進(jìn)行研究,以求明確各個(gè)藥物的有效成分及相互的藥理作用,對(duì)提高制備后中成藥質(zhì)量控制及臨床療效有重要的意義,因此這也成為近年來中藥研究的熱點(diǎn)。目前在加味逍遙丸的藥物研究中,多為使用薄層色譜法、高效液相色譜法等進(jìn)行藥物的有效成分及含量的鑒定[4-7],而這些檢測(cè)方法,常常不能對(duì)加味逍遙丸中會(huì)發(fā)性成分加以檢測(cè)及定性鑒別。而在組成加味逍遙丸的多種中藥均含有揮發(fā)性的藥物成分,例如當(dāng)歸、梔子、丹參、柴胡、白術(shù)、芍藥、薄荷、生姜中均含有揮發(fā)性的藥物成分,而這些成分也是加味逍遙丸的有效藥物組成,忽視這些揮發(fā)性藥物的研究,則對(duì)成藥組方的藥理、藥效和質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面的研究均是不夠客觀或較為片面的,這將不利于中成藥制作工藝和質(zhì)量控制體系的提升。氣相色譜-質(zhì)譜分析(Gas Chromatography-mass Spectrometry,GC-MS),是一種將氣相色譜(Gas Chromatography,GC)[8]和質(zhì)譜分析(Mass Spectrometry,MS)[9]聯(lián)合應(yīng)用的技術(shù)。它可直接使用GC分離樣品,并使分離后的化合物通過MS進(jìn)行離子化,同時(shí)具有GC的高效分離和MS的準(zhǔn)確定量的有點(diǎn),故而目前已經(jīng)成為研究揮發(fā)性化合物的最為有效及普遍的方法之一。本研究使用GC-MS對(duì)加味逍遙丸中揮發(fā)性成分進(jìn)行分離及鑒定,旨在更為全面、客觀的了解加味逍遙丸中各種揮發(fā)性有效成分的組成和藥效,提供有效的鑒定方法,以期為逍遙丸的氣相色譜指紋圖譜及藥物質(zhì)量管理提供客觀依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 揮發(fā)油提取器(型號(hào):DGT,供應(yīng)商:天津市德固特科技發(fā)展有限公司);氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(型號(hào):GCMS-QP2010,供應(yīng)商:日本島津公司);氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器(型號(hào)6890N;供應(yīng)商:美國(guó)Agilent公司)。

1.2 試劑 正己烷和正十八烷均購于北京中科儀友化工技術(shù)研究院;實(shí)驗(yàn)用二次蒸餾水。

1.3 分析樣品 加味逍遙丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠,國(guó)藥準(zhǔn)字Z11020248)。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC-MS色譜質(zhì)譜條件 色譜條件:選擇直徑為0.25 μm的Rxi-5ms的色譜柱(規(guī)格:30 m×0.25 mm),柱流量為1 mL/min;以氦氣(He)為載氣,采用30∶ 1的分流比;進(jìn)樣量:0.5 μL,以260 ℃為進(jìn)樣口溫度,升溫程序:首先保持初始柱溫60 ℃ 3 min,隨后以10 ℃/min的升溫速率升至175 ℃,再下降10倍升溫速率以1 ℃/min緩慢升溫至195 ℃,最后增加5倍升溫速率以5 ℃/min升溫至240 ℃,維持15 min后再緩慢升至250 ℃的接口溫度;溶劑延遲時(shí)間為3 min。質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源的轟擊能量設(shè)置為70 eV,離子源溫度設(shè)置為200 ℃;以0.7 KV為檢測(cè)電壓;采用全譜掃描,其質(zhì)量掃描范圍為m/z 40～550 amu,質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫參照NIST庫。

2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 采用容量瓶精密量取100 μL正十八烷作為內(nèi)標(biāo)物,以10 mL正己烷定容,配制出濃度為7.8 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取18 g加味逍遙丸樣品粉碎物,倒入500 mL圓底燒瓶中,為充分使加味逍遙丸樣品碎裂細(xì)小化,在圓底燒瓶中加入270 mL二次蒸餾水并室溫浸泡10 h;加味逍遙丸揮發(fā)性成分提取參照《中華人民共和國(guó)藥典》[10]附錄XD“揮發(fā)油測(cè)定法”甲法的實(shí)驗(yàn)規(guī)定,加熱圓底燒瓶使樣品溶液微微沸騰,并保持水蒸餾微沸狀態(tài)11 h,采用揮發(fā)油提取器收集揮發(fā)性成分;加入適量無水硫酸鈉到蒸餾所得到的揮發(fā)性成分中幫助其干燥除水,將干燥后的揮發(fā)性成分小心移取至1.5 mL樣品瓶中,加入精密量取的7.8 mg/mL正十八烷內(nèi)標(biāo)溶液100 μL,并以正己烷定容至1.5 mL,充分混合均勻既得供試品溶液,4 ℃下密封保存待用。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)提取時(shí)間、固液比和浸泡時(shí)間這3個(gè)重要實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié)果顯示,將提取時(shí)間9 h、固液比1∶ 15、浸泡時(shí)間10 h時(shí)是水蒸餾法提取加味逍遙丸中揮發(fā)性成分的最佳提取條件。

2.5 專屬性試驗(yàn) 取同一供試品溶液根據(jù)2.3制備的供試品溶液各5 μL,加味逍遙丸專屬性試驗(yàn)采用薄層層析方法(TLC)進(jìn)行操作,將供試品溶液分別點(diǎn)于同一片硅膠G薄層色譜板,以環(huán)乙烷和乙酸乙酯作為展開劑,配比為19∶ 1;晾干后隨即將40%硫酸溶液(含有2%對(duì)二甲氨基苯甲醛)噴在色譜板上,加熱至100 ℃,冷卻5 min后在紫外光燈(波長(zhǎng)365 nm)下觀察,專屬性試驗(yàn)結(jié)果顯示加味逍遙丸的專屬性良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 提取1份按照2.3項(xiàng)下GC-MS分析條件制備的加味逍遙丸樣品溶液,連續(xù)測(cè)定6次,以內(nèi)標(biāo)物正十八烷的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積作為參照,計(jì)算得到各主要峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間(Tr=Ti/Ts)的RSD(n=6)為0.0074%～0.24%,相對(duì)峰面積(Ar=Ai/As)的RSD(n=6)為0.41%～4.7%,均符合RSD小于5%的要求,表明氣相色譜精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 提取1份按照2.3項(xiàng)下GC-MS分析條件制備的加味逍遙丸樣品溶液,分別在8個(gè)不同時(shí)間段內(nèi)(0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h)進(jìn)行檢測(cè),以內(nèi)標(biāo)物正十八烷的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積作為參照,計(jì)算得到各主要峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間(Tr=Ti/Ts)的RSD(n=8)為0.0065%～0.32%,相對(duì)峰面積(Ar=Ai/As)的RSD(n=8)為0.33%～4.9%,均符合RSD小于5%的要求,說明了加味逍遙丸樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 提取6份按照2.3項(xiàng)下GC-MS分析條件制備的同一批次加味逍遙丸樣品溶液,以內(nèi)標(biāo)物正十八烷的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積作為參照,計(jì)算得到各主要峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間(Tr=Ti/Ts)的RSD(n=6)為0.018%～0.51%,相對(duì)峰面積(Ar=Ai/As)的RSD(n=6)為0.19%～4.8%,均符合RSD小于5%的要求,證明了GC-MS試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

2.9.1 加味逍遙丸揮發(fā)性成分總離子流色譜圖 加味逍遙丸在氣相色譜-質(zhì)譜研究中以正十八烷(S)為內(nèi)標(biāo)物,檢測(cè)到53中揮發(fā)性成分。見圖1。

2.9.2 加味逍遙丸揮發(fā)性成分分析 將總離子流色譜圖中所檢測(cè)出的色譜峰與NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行參照比較,分析53個(gè)揮發(fā)性成分的具體化學(xué)成分信息,其中芳香族類和萜烯類揮發(fā)性成分均有11種,萜醇類揮發(fā)性成分有8中種,醛類揮發(fā)性成分有6種。見表1。

3 討論

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)是一種氣相色譜和質(zhì)譜檢測(cè)聯(lián)合使用的檢測(cè)技術(shù),自從1957年被開發(fā)以來,GC-MS技術(shù)已經(jīng)成為目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)手段。幾乎在所有的中藥檢測(cè)分析中,特別是如中成藥等復(fù)雜的混合物檢測(cè),GC-MS已經(jīng)成為主要的藥品定性、定量檢測(cè)最為有效的方法之一[11]。例如,陳智煌等[12]使用GC-MS法對(duì)羌活的揮發(fā)油成分進(jìn)行分析,并確定其相關(guān)成分的特征指紋圖譜,總結(jié)了羌活揮發(fā)油具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用的主要藥理成分。薛子鈺等[13]則使用GC-MS對(duì)不同炮制方法的當(dāng)歸進(jìn)行觀察,分析了當(dāng)歸揮發(fā)油的成分及對(duì)大鼠尿液代謝可能起到作用的相關(guān)機(jī)制。本研究在使用GC-MS對(duì)加味逍遙丸的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究,可較為全面的、綜合的反應(yīng)出不同揮發(fā)性成分間的差異。

圖1 加味逍遙丸揮發(fā)性成分總離子流色譜圖

注：S為內(nèi)標(biāo)物正十八烷

表1 加味逍遙丸揮發(fā)性成分分析

3.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 使用正構(gòu)烷烴作為內(nèi)標(biāo)的參照物進(jìn)行GC分析。在分別使用正已烷、正十二烷、正十四烷、正十六烷、正十八烷等進(jìn)行連續(xù)測(cè)樣3次后,正十二烷、正十四烷的色譜峰位間相互距離較大,而正十六烷峰位與樣品重疊,不利于樣品揮發(fā)性的成分檢測(cè),均不作為內(nèi)標(biāo)參照物,故在篩選后選用正十八烷作為內(nèi)標(biāo),正已烷定容,制備出對(duì)檢驗(yàn)樣品無干擾的內(nèi)標(biāo)溶液。

3.2 揮發(fā)性成分的提取 揮發(fā)性成分多存在于植物的花、根、葉、根莖、果實(shí)和種子中,多為萜類、芳香族類、脂肪族類和含氮含硫化合物等,其中萜類及其含氧衍生物在揮發(fā)油中具有較高的含量,芳香族化合物通常具有生物活性,是揮發(fā)油特異芳香氣味的來源[14];本研究結(jié)果與上述描述一致,結(jié)果顯示,總離子流色譜圖中分析53個(gè)揮發(fā)性成分的具體化學(xué)成分信息,其中芳香族類和萜烯類揮發(fā)性成分均有11種。揮發(fā)性成分的提取分離技術(shù),決定了后續(xù)質(zhì)量研究的品質(zhì)。目前揮發(fā)性成分的提取方法有很多,如水蒸餾法、超聲提取技術(shù)等[15],在加味逍遙丸揮發(fā)性成分研究的提取中常用的水蒸餾提取法和超聲技術(shù)提取法[16],其中水蒸餾法是《中華人民共和國(guó)藥典》推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法;而超聲提取法是通過機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng),平衡提取溶劑并提高揮發(fā)性成分的溶解度。有研究人員在采用水蒸餾法和超臨界CO2流體萃取法提取逍遙散揮發(fā)性成分的研究中,水蒸餾法提取所得的揮發(fā)性成分較超臨界CO2流體萃取法提取所得的揮發(fā)性成分復(fù)雜,因此本研究采用水蒸餾法提取加味逍遙丸中的揮發(fā)性成分。

3.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在稱取18 g加味逍遙丸后,將其粉碎,碎后的顆粒放置于500 mL圓底燒瓶中,加入一定量的蒸餾水后,分別選擇不同提取時(shí)間(4 h、6 h、8 h、9 h、10 h)、藥品與蒸餾水的不同固液比(1∶ 5、1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20)、不同浸泡時(shí)間(2 h、6 h、10 h、14 h、18 h)作為干預(yù)條件,觀察不同條件下對(duì)相對(duì)峰面積的影響。在分別進(jìn)行多次不同的平行試驗(yàn)后,我們可確定,在選擇加味逍遙丸顆粒與蒸餾水固液比為1∶ 15、浸泡10 h,提取時(shí)間為9 h時(shí),其相對(duì)峰面積為最大,表明其為最佳實(shí)驗(yàn)條件,故選擇此作為正交實(shí)驗(yàn)條件[17-18]。

3.4 色譜柱的選擇 在GC-MS分析法中,選擇正確的毛細(xì)管柱,對(duì)結(jié)果的精密性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性及可重復(fù)性的影響至關(guān)重要。在分別比較agilent CP-SIL5CB、CP-SIL13CB、CP-SIL24CB、HP-1、HP-5等毛細(xì)管柱后,發(fā)現(xiàn)HP-5(30 m×0.32 mm,0.25 μm)具有較好的分離度,柱效和所獲得的色譜峰數(shù)較好。