加味四君子對(duì)宮頸癌大鼠模型癌組織中Caspase-3、Caspase-7、Survivin表達(dá)的干預(yù)作用

王 劍 張 軼 劉月芬 毛寶宏 王文第 劉 青

(1 甘肅省婦幼保健院婦幼保健科研中心,蘭州,730050; 2 蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司,蘭州,730046)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一,僅有少數(shù)患者早期出現(xiàn)陰道分泌物異常、陰道接觸性出血等癥狀,大部分患者并未出現(xiàn)任何臨床癥狀,直至晚期因癌組織浸潤(rùn)其他組織器官出現(xiàn)繼發(fā)性癥狀時(shí)疾病才被發(fā)現(xiàn),具有極強(qiáng)的隱匿性[1]。因此探尋特異性指標(biāo)做到盡早發(fā)現(xiàn)疾病是目前臨床研究的重點(diǎn)。中醫(yī)藥的抗癌效果逐漸得到認(rèn)可,四君子湯有益氣健脾之功,首載自《太平惠民和劑局方》,臨床不乏四君子湯加減有效抗腫瘤的報(bào)道[2-4],但其作用機(jī)制目前尚無統(tǒng)一定論,一定程度限制了其臨床的推廣應(yīng)用?；诖?我們亦宮頸癌模型大鼠為研究對(duì)象,進(jìn)行加味四君子湯干預(yù),臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考,具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Wistar雌性大鼠30只均購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(合格證:S20089382),平均值中(155±15)g,鼠齡均為6周。飼養(yǎng)于蘭州生物制品研究所SPF動(dòng)物房中心,飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置:溫度22～24 ℃，平均溫度(22±1.28)℃,濕度53%～55%,平均濕度(54±0.27)%。所有Wistar進(jìn)行為期3 d的適應(yīng)性喂養(yǎng),隨后將30只大鼠隨機(jī)分為空白組10只,造模組20只,其中造模組大鼠接受宮頸癌模型制備,造模后隨機(jī)分為模型組和干預(yù)組。3組大鼠在鼠齡、體重方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.1.2 藥物 加味四君子湯詳方如下:人參12 g、白術(shù)9 g、茯苓9 g、半枝蓮9 g、金銀花9 g、香附6 g、黃柏6 g、鳳尾草6 g、甘草3 g,所有中藥均購(gòu)自四川拓荒牛中藥材種植有限公司,水煎備用。

1.1.3 試劑與儀器 人宮頸癌Hela細(xì)胞株(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所),10%水合氯醛(購(gòu)自青島宇龍海藻有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H37022673),4%多聚甲醛(購(gòu)自武漢百浩天生物科技有限公司),-actin、Caspase-3、Caspase-7、Survivin一抗抗體(均購(gòu)自美國(guó)CST公司),BCA蛋白定量試劑盒(購(gòu)自碧云天生物有限公司),DAB試劑盒(購(gòu)自Solarbio公司),RPMI-1640培養(yǎng)液(購(gòu)自江萊生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將人宮頸癌Hela細(xì)胞株置于RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行培育,將培養(yǎng)瓶置于37 ℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度環(huán)境中,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)加入適量的0.25%的胰酶進(jìn)行消化,充分消化后用小牛血清培養(yǎng)基終止消化,將細(xì)胞液置于4 ℃離心機(jī)中1 500 r/min離心10 min,充分洗滌后將細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整為107個(gè)/mL。將大鼠置于無菌手術(shù)操作臺(tái),在大鼠腋窩皮下組織注射0.5 mL人宮頸癌Hela細(xì)胞懸液,常規(guī)飼養(yǎng)7 d后大鼠出現(xiàn)明顯的腫瘤結(jié)節(jié)提示造模成功,反之則提示造模失敗[5]。本研究對(duì)20只大鼠進(jìn)行模型制備,其中2只大鼠未出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié),提示造模失敗,將18只造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組及干預(yù)組，每組9只。

1.2.2 干預(yù)方法 干預(yù)組大鼠每天接受加味四君子湯灌胃,以150 mg/kg·d劑量進(jìn)行干預(yù),所有大鼠均只有飲食且術(shù)后飼養(yǎng)環(huán)境相同。1劑/d,空白組及模型組大鼠僅每天接受模擬抓取,并用等體積的生理鹽水灌胃。各組大鼠均連續(xù)干預(yù)8周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 宮頸癌病灶大小 對(duì)模型組及干預(yù)組大鼠的宮頸癌病灶大小進(jìn)行測(cè)量,記錄長(zhǎng)、寬、高的數(shù)據(jù),并計(jì)算出體積。

1.2.3.2 Western blotting法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-7濃度變化 干預(yù)結(jié)束后各取模型組及干預(yù)組各3只大鼠的腫瘤組織50 mg,空白組3只大鼠腋窩皮下組織50 mg。分別加入蛋白裂解液將組織的充分裂解勻漿,用BCA試劑盒對(duì)各樣本的蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定,隨后將樣本在水浴中進(jìn)行蛋白變性,取出適量樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳跑膠,隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、內(nèi)參及Caspase-3、Caspase-7抗體孵育,隨后將目標(biāo)PVDF膜充分洗滌后進(jìn)行二抗孵育,加入ECL顯影液后進(jìn)行圖片顯影,讀取OD值,并用Image(BIO-RAD公司)的圖像處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.3.3 免疫組化法檢測(cè)Survivin水平變化 干預(yù)結(jié)束后隨機(jī)抓取各組3只大鼠腹腔注入10%水合氯醛充分麻醉后腹主動(dòng)脈灌注4%多聚甲醛進(jìn)行組織固定,模型組及干預(yù)組取出腫瘤組織,空白組取腋窩皮下組織,進(jìn)行組織脫水、包埋、切片、固定,隨后將切好的組織片進(jìn)行脫蠟,在進(jìn)行抗原修復(fù)、加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑,隨后用PBS沖洗,避光環(huán)境下加入DBA溶液進(jìn)行顯色,調(diào)整顯色時(shí)間后用自來水將DAB沖洗干凈,封片,顯微鏡下讀片,每張載玻片片隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察并計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌病灶大小的變化 空白組未出現(xiàn)宮頸癌病灶,模型組病灶體積(1 573.48±11.24) mm3,干預(yù)組病灶體積(683.23±4.81) mm3,各組宮頸癌病灶大小差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),干預(yù)組明顯較模型組小。見表1。

表1 各組宮頸癌病灶大小

圖1 各組Caspase-3、Caspase-7 Western blot電泳結(jié)果

組別Caspase-3/內(nèi)參IOD比值Caspase-7/內(nèi)參IOD比值空白組4.723±1.0213.634±0.035模型組1.162±0.1370.479±0.223干預(yù)組2.571±1.1261.984±0.121Z8.2874.323P0.0030.002

圖2 各組Survivin濃度的變化

組別Survivin光密度空白組34.382±1.281模型組502.132±0.932干預(yù)組212.531±1.281Z7.243P0.025

2.2 各組大鼠Caspase-3、Caspase-7、Survivin濃度變化 2組接受造模術(shù)大鼠Caspase-3、Caspase-7濃度均有不同程度下調(diào),Survivin表達(dá)升高,其中干預(yù)組大鼠經(jīng)過為期8周的干預(yù)后Caspase-3、Caspase-7濃度上調(diào),Survivin濃度下降,干預(yù)組改善明顯優(yōu)于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、圖2及表2、表3。

3 討論

宮頸癌是目前臨床常見的婦科惡性腫瘤,手術(shù)在早期介入有較理想的臨床療效,但該病發(fā)生發(fā)展隱匿,多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)疾病時(shí)依然處于中晚期,喪失了手術(shù)最佳時(shí)間窗,由此新輔助化療成為中晚期宮頸癌的主要治療手段[6],然而通過長(zhǎng)期的臨床觀察我們發(fā)現(xiàn),雖然化療藥物可直接作用于瘤體抑制其生長(zhǎng),但與此同時(shí)帶來的不良反應(yīng)亦給患者造成了嚴(yán)重的影響,阻礙了治療依從性。中醫(yī)藥以其療效顯著,安全性高等諸多優(yōu)勢(shì)被逐漸運(yùn)用于抗癌臨床治療中,中醫(yī)認(rèn)為宮頸癌屬于“崩漏”“帶下”“癥瘕”等范疇,《黃帝內(nèi)經(jīng)》云:“正氣存內(nèi)、邪不可干”“蓋沖任失調(diào),督脈失司,帶脈不固,因而帶下”。宋代醫(yī)學(xué)家陳自明在其代表作《婦人大全良方》寫道:“產(chǎn)后血?dú)鈧谂K腑,臟腑虛弱為風(fēng)冷所乘,搏于臟腑,與氣血相結(jié),故成積聚瘢塊也”。由此不難看出氣血虧虛是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要病因,婦人機(jī)體正氣虧虛,臟腑功能失調(diào),外邪趁虛而入,或因寒濕,或因痰瘀,侵襲胞宮,脈絡(luò)阻滯,郁久化熱,熱瘀毒郁結(jié)于宮頸而成此病,故健脾益氣,清熱解毒,化瘀散結(jié)是治療本病的關(guān)鍵[7]。本研究在四君子湯基礎(chǔ)上加用清熱解毒散瘀之品,方中人參益氣健脾養(yǎng)胃,氣血生這正氣充盈;白術(shù)健脾燥濕,加強(qiáng)人參的益氣之功;茯苓甘淡滲濕,白術(shù)、茯苓合用促使健脾祛濕之功倍增;方中半枝蓮、金銀花以清熱解毒,香附首載于陶弘景的《名醫(yī)別錄》,有理氣之功,是氣病之總司,女科之主帥。黃柏有清熱解毒的功效,如膀胱、大腸經(jīng),可清除下焦?jié)駸?《神農(nóng)本草經(jīng)》描述到:“主五臟腸胃中結(jié)熱,女子漏下赤白,陰傷性疾”。鳳尾草味淡微苦,主入大腸經(jīng)及心經(jīng),《分類草藥性》曰:“鳳尾草,可主一切熱毒之疾,可消腫清火也”,是專治婦人疾病之良品。甘草可調(diào)和諸藥藥性,又可健脾胃以固中氣之虛羸,調(diào)和陰陽以平衡營(yíng)衛(wèi)之勢(shì)。整方共奏益氣健脾,扶正固本,清熱解毒散瘀之功。

在對(duì)加味四君子湯作用機(jī)制的進(jìn)一步研究中我們發(fā)現(xiàn)其可影響Caspase-3、Caspase-7、Survivin的濃度變化,可上調(diào)宮頸癌模型大鼠Caspase-3、Caspase-7的濃度,抑制Survivin的表達(dá)。宮頸癌病情的進(jìn)展與腫瘤細(xì)胞的過度增殖及凋亡減弱有關(guān)[6-10],誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡是抗癌的主要方向,腫瘤細(xì)胞的凋亡減弱,導(dǎo)致機(jī)體原本細(xì)胞增殖/凋亡平衡受破壞,導(dǎo)致大量的腫瘤細(xì)胞無法正常凋亡而出現(xiàn)異常增殖,病情日久則腫瘤病灶日趨增大,并逐漸向其他組織或器官侵潤(rùn)擴(kuò)散,因此抑制腫瘤細(xì)胞的過度增殖,促進(jìn)其凋亡是抗癌的靶向[11-14]。Caspase家族是介導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)周期的重要因子,其中Caspase-3、Caspase-7是其關(guān)鍵成員,其濃度升高可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Survivin[15-17]是目前公認(rèn)的抑制細(xì)胞凋亡的因子,Survivin可通過激活因子酶原的活性而產(chǎn)生抑癌效應(yīng),有研究發(fā)現(xiàn)健康肌體Survivin幾乎無表達(dá),而宮頸癌腫瘤組織中的Survivin呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[18],因此有研究人員[19-20]認(rèn)為Survivin可作為診斷及評(píng)估惡性腫瘤治療療效的獨(dú)立因子。在本研究中我們認(rèn)為加用加味四君子湯的大鼠Caspase-3、Caspase-7表達(dá)上調(diào),Survivin水平減弱,由此我們認(rèn)為加味四君子湯可通過誘導(dǎo)促凋亡抑制的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,重新維護(hù)增殖與凋亡間的平衡,抑制腫塊的生長(zhǎng),縮小腫瘤組織體積。

由此,我們認(rèn)為加味四君子湯有明顯的抗癌功效,可顯著縮小宮頸癌病灶體積,其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Caspase-3、Caspase-7、Survivin表達(dá)而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān),臨床建議推廣運(yùn)用。