腎復(fù)康對(duì)腎纖維化模型大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、Smad2、Smad7表達(dá)的影響

劉勁松 林 哲 鄭燕姣

(湖南省中醫(yī)院研究院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，長(zhǎng)沙，410006)

腎間質(zhì)纖維化是諸多腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的共同病理過(guò)程[1-3]，腎纖維化的發(fā)生提示腎功能惡化，因此深入研究腎纖維化的機(jī)制，探索有效的干預(yù)措施抑制腎纖維化過(guò)程是減少諸多腎臟疾病和延緩其病情發(fā)展的關(guān)鍵。腎纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“水腫”“關(guān)格”“虛勞”等范疇，歷代醫(yī)家認(rèn)為腎纖維化過(guò)程中素體正氣逐漸虛損，邪毒日漸瘀滯，長(zhǎng)期的正邪相爭(zhēng)后形成邪盛正虛的病理變化[4-6]。近年來(lái)中草藥以其毒性低、療效顯著等優(yōu)勢(shì)被眾多科研工作者納入研究。腎復(fù)康是我院經(jīng)驗(yàn)方，由土黃芪、太子參、生地黃、山茱萸、茯苓、白花蛇舌草、蟬花、丹參、大黃等藥物組成，有顯著的健脾補(bǔ)腎、瀉濁排毒的作用，本研究嘗試通過(guò)HE染色實(shí)驗(yàn)、免疫組化實(shí)驗(yàn)、Western blotting檢測(cè)，觀察腎復(fù)康對(duì)腎纖維化模型大鼠的影響，旨在為中醫(yī)防治腎纖維化提供新思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取SPF級(jí)SD大鼠70只，雌雄各半，體重(200±20)g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為№3567824。飼養(yǎng)條件：溫度(23±1)°C，濕度(50±1)%，以12/12 h為光暗周期。

1.1.2 藥物 腎復(fù)康(生黃芪30 g、太子參15 g、生地黃15 g、山茱萸15 g、茯苓15 g、白花蛇舌草30 g、忍冬藤30 g、蟬花15 g、丹參15 g、大黃8 g)，由湖南省中醫(yī)藥研究院中心藥房提供。

1.1.3 試劑與儀器 24 UP測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號(hào)20170819)、SCr測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號(hào)20179812)、BUN測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號(hào)20170521)，TGF-β1一抗(美國(guó)CST生物公司,型號(hào)：BY-3283R)，Smad2(美國(guó)CST生物公司,型號(hào)：BY-3551R)、Smad7(美國(guó)CST生物公司,型號(hào)：BY-3526R)。4%多聚甲醛溶液(上海西塘生物試劑有限公司)，蘇木精-伊紅(HE)(上海西塘生物試劑有限公司)，鹽酸溶液(上海西塘生物試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1)分組：于實(shí)驗(yàn)條件下適應(yīng)環(huán)境3 d后，隨機(jī)挑選10只作為假手術(shù)組，其余大鼠禁食12 h后進(jìn)行造模，造模成功后隨機(jī)分為腎復(fù)康組(低劑量組15只、中劑量組15只及高劑量組15只)及模型組(15只)[7]。各組在性別、體重、鼠齡等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2)模型制備：將大鼠進(jìn)行禁食不禁水12 h后利用10%水合氯醛以0.3 mL/kg的劑量進(jìn)行麻醉，造模過(guò)程根據(jù)大鼠的麻醉情況可適當(dāng)補(bǔ)充水合氯醛，充分麻醉后將大鼠以右側(cè)臥位的體位固定于手術(shù)臺(tái)上，將左側(cè)腹部皮毛剔除，露出手術(shù)部分，利用75%乙醇常規(guī)消毒后從背部距左側(cè)肋脊角1.5 cm處做一長(zhǎng)約2 cm的斜切口，用分離鉗將皮膚肌肉逐層鈍性分離，直至將左側(cè)腎臟充分暴露，隨后將左側(cè)輸尿管鈍性分離暴露，并在近腎門(mén)處和輸尿管上1/3處進(jìn)行雙重結(jié)扎，最后將左側(cè)腎臟回納原位后逐層縫合。

1.2.2 干預(yù)方法 1)給藥劑量：根據(jù)成人與大鼠用藥劑量換算法腎復(fù)康制作成水平4.58、9.16、18.32 g/(kg·d)進(jìn)行灌胃。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛，2～3 mL/kg腹腔麻醉。模型組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸L尿管但不結(jié)扎，腎復(fù)康組、模型組在造模成功后，動(dòng)物清醒1 h后灌胃給藥。假手術(shù)組(4 mL蒸餾水灌胃)、模型組(4 mL蒸餾水灌胃)，腎復(fù)康組，各組造模后每日灌胃2次，時(shí)間分別為9：00和15：00，連續(xù)21 d，直到處死為止。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)24 UP、SCr、BUN水平:處死前1 d收集各組籠內(nèi)24 h尿液，根據(jù)相關(guān)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行24 UP、SCr、BUN水平的檢測(cè)。2)腎臟組織病理學(xué)觀察：各組隨機(jī)選取3只大鼠，將左腎取出后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，并按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行脫水、石蠟包埋，隨后將蠟塊進(jìn)行修切后制成4 μm厚度的切片，并將切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，隨后用顯微鏡觀察各組左腎組織的染色結(jié)果。參參考文獻(xiàn)[8]對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，0分為腎臟組織未見(jiàn)病理性改變；1分為腎臟組織出現(xiàn)輕度腎小管擴(kuò)張、萎縮或壞死，病變范圍≤1/4；2分為腎臟組織出現(xiàn)中度腎小管擴(kuò)張、萎縮或壞死，1/4<病變范圍≤1/2；3分為腎臟組織出現(xiàn)中度腎小管擴(kuò)張、萎縮或壞死，病變范圍>1/2。每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，取平均值作為最終結(jié)果。3)用Western blotting檢測(cè)Smad2 Smad7和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)水平：各組隨機(jī)選取3只大鼠，剪取左腎組織約100 mg，加入裂解液充分裂解組織，將溶液高速離心(4 ℃,1 000 r/min)15 min，抽取上清液進(jìn)行蛋白定量，并根據(jù)相應(yīng)的蛋白水平計(jì)算上樣量。將各組標(biāo)本溶液于金屬浴鍋100 ℃條件下變性10 min，按照碧云天膠體配制說(shuō)明書(shū)事先配制電泳膠體，加入樣本后進(jìn)行電泳，后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、染色、封閉蛋白，最后將反應(yīng)膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀上，加入ECL發(fā)光液顯影，隨后進(jìn)行A值讀取。4)免疫組化檢測(cè)TGF-β1水平：各組隨機(jī)選取3只大鼠，將左腎取出后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，并按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行脫水、石蠟包埋，隨后將蠟塊進(jìn)行修切后制成4 μm厚度的切片，將切片經(jīng)過(guò)新鮮二甲苯、梯度乙醇、自來(lái)水、磷酸鹽緩沖液(PBS)分別沖洗后將切片置于抗原修復(fù)液中進(jìn)行修復(fù)，隨后加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，充分反應(yīng)后連續(xù)使用PBS浸洗，后加入非特異性染色阻斷劑后加入1∶ 1 000配制的TGF-β1抗體，將反應(yīng)物置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育24 h，隨后再次用PBS浸洗，最后用自來(lái)水浸洗去除切片表面的PBS，用二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)進(jìn)行顯色后用蘇木精染色，隨之自來(lái)水沖洗、返藍(lán)、乙醇、二甲苯浸泡后用中性樹(shù)脂封片，最后在光鏡下讀片。

表1 5組24 UP、SCr、BUN比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

2 結(jié)果

2.1 5組24 UP、SCr、BUN比較 與假手術(shù)組比較，腎復(fù)康組及模型對(duì)照組24 UP、SCr及BUN水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，腎復(fù)康組24 UP、SCr及BUN水平有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著腎復(fù)康劑量升高趨勢(shì)更明顯。見(jiàn)表1。

2.2 5組腎臟組織病理學(xué)比較 與假手術(shù)組比較，腎復(fù)康組及模型組腎組織病理評(píng)分均明顯升高，其中腎復(fù)康組評(píng)分低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著腎復(fù)康劑量的增加病理評(píng)分逐漸下降。見(jiàn)表2。

2.3 5組TGF-β1、Smad2 Smad7比較 假手術(shù)組腎組織僅有少量TGF-β1、Smad2表達(dá)，模型組Smad2、TGF-β1呈高表達(dá)，隨著腎復(fù)康水平的增加Smad2、TGF-β1水平逐漸下降。造模后Smad7水平下降，腎復(fù)康干預(yù)后Smad7水平有所上調(diào)，并隨著水平的增加而上調(diào)趨勢(shì)更明顯。見(jiàn)表3～4及圖1。

表2 5組腎臟組織病理學(xué)比較分)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

表3 5組TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

表4 5組Smad2、Smad7/內(nèi)參(IOD比值)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

圖1 5組Smad2、Smad7蛋白表達(dá)

3 討論

古代醫(yī)學(xué)書(shū)籍并無(wú)“腎纖維化”這一說(shuō)法，結(jié)合該病的臨床癥狀認(rèn)為其屬于“水腫”“關(guān)格”“虛勞”等范疇。此病與脾腎兩臟關(guān)系密切，脾腎分清泌濁能力是否正常是關(guān)于本病是否發(fā)生的關(guān)鍵，而脾腎的分清泌濁能力有賴于氣化而進(jìn)行。機(jī)體中肺、脾、肝等功能的異常均可影響氣化，腎氣虧虛更是氣化異常的根本，氣化不足則機(jī)體分清泌濁障礙，則水液、毒物無(wú)法及時(shí)轉(zhuǎn)輸及運(yùn)化，從而產(chǎn)生了濕濁、血瘀等病理產(chǎn)物[7-8]。有臨床資料顯示，腎纖維化是形成是一個(gè)漫長(zhǎng)的、難治的過(guò)程，久病必虛，隨著正氣逐漸耗損，邪毒瘀積漸盛，正邪相爭(zhēng)后致邪盛正虛，故腎纖維化形成的各個(gè)階段均以正氣虛損為主，瘀血形成為標(biāo)[9-12]?；诖擞醒芯咳藛T對(duì)治療腎纖維化的中藥復(fù)方進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘分析，結(jié)果顯示補(bǔ)益藥使用頻率占首位，隨之是活血化瘀藥及清熱藥[13]。在單味藥使用總結(jié)中發(fā)現(xiàn)黃芪是使用頻率最高的中藥，依次是大黃、當(dāng)歸、丹參、川芎、牛膝、山藥?？梢?jiàn)正因?yàn)榇嬖凇罢摗?，故補(bǔ)益藥占據(jù)比例最大，而本研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀藥使用頻率僅次于補(bǔ)益類(lèi)藥物，因此我們認(rèn)為活血化瘀亦應(yīng)是治療腎纖維化的基本方法。本研究所使用腎復(fù)康由我院腎病專(zhuān)家肖德才教授根據(jù)腎臟病中醫(yī)病因、病機(jī)，總結(jié)幾十年臨床經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)立。方中黃芪、太子參有益氣之功，生地黃、山茱萸以及茯苓可加強(qiáng)健脾功效，且有補(bǔ)腎作用；現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示黃芪可明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，而山茱萸可明顯改善腎小球?yàn)V過(guò)功能。白花蛇舌草、忍冬藤、蟬花、大黃、丹參具有清熱瀉濁、排毒化瘀的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)白花蛇舌草、大黃等提取物有明顯消炎效應(yīng)，并可顯著降低肌酐改善腎功能。腎復(fù)康藥物配伍共奏健脾益腎，泄?jié)崤哦?，充分體現(xiàn)辨證施治的特點(diǎn)[14]。前期研究已證實(shí)，腎復(fù)康可明顯改善原發(fā)性膜性腎病患者的臨床癥狀，減少尿蛋白，提高機(jī)體免疫[15]。本研究觀察了5組腎組織病理學(xué)改變，其中假手術(shù)組并未出現(xiàn)明顯異常，而造模組出現(xiàn)了不同程度腎小管擴(kuò)張、萎縮或壞死，其中腎復(fù)康組隨著水平的升高病情逐漸改善，并且大鼠的腎功能亦有了明顯改善，這證實(shí)了腎復(fù)康確可在一定程度改善腎功能。

在對(duì)作用機(jī)制的研究中我們對(duì)各組的腎臟組織的TGF-β1/Smad信號(hào)通路進(jìn)行檢測(cè)，機(jī)體具有多種因子可導(dǎo)致腎纖維化，各種致纖維化因子之間亦存在復(fù)雜的關(guān)系，TGF-β是具有明顯的促進(jìn)腎纖維化生物學(xué)效應(yīng)[16]，對(duì)于腎臟細(xì)胞的增殖、分泌、遷移及凋亡過(guò)程均有參與[17-19]。Smad是目前認(rèn)為的細(xì)胞內(nèi)唯一存在的TGF-β相應(yīng)酶激活物，可介導(dǎo)TGF-β的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，TGF-β1可將細(xì)胞膜表面相應(yīng)的I型受體相結(jié)合，形成復(fù)雜的Smad2、Smad3及Smad7等因子，Smad2可誘使生物因子并核移位轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生生物效應(yīng)，Smad7是TGF-β蛋白在信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控因子，在腎小球及腎小管組織有豐富的表達(dá)，TGF-β1/Smad信號(hào)通路是著眼腎纖維化的關(guān)鍵[20-21]。研究中假手術(shù)組腎組織僅有少量TGF-β1、Smad2表達(dá)，模型組Smad2、TGF-β1高表達(dá)，隨著腎復(fù)康水平的增加Smad2、TGF-β1水平逐漸下降。造模后Smad7水平下降，腎復(fù)康干預(yù)后Smad7水平有所上調(diào)，并隨著水平的增加而上調(diào)得趨勢(shì)更明顯。這提示腎復(fù)康可通過(guò)抑制TGF-β對(duì)Smads的激活，從而抑制TGFβ/Smad信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少腎纖維化程度，且其作用效應(yīng)具有一定的劑量依賴性。