蜈蚣草內(nèi)生及根際砷還原菌的表征

王 姣，田海霞，和文祥

（西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北植物營(yíng)養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100）

砷（As）是一種有毒的類金屬，可通過(guò)自然環(huán)境作用或人類活動(dòng)釋放到環(huán)境中[1-2]，并對(duì)人類健康造成極大的威脅[3]。其中無(wú)機(jī)砷主要以五價(jià)砷[As（V）]和三價(jià)砷[As（Ⅲ）][4-5]形態(tài)存在，二者生物毒性相差60～80倍。由于環(huán)境條件的變化，會(huì)導(dǎo)致土壤中砷形態(tài)的轉(zhuǎn)化，此過(guò)程極有可能受到砷還原菌的調(diào)控。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)砷還原菌開(kāi)展了研究工作，如Krumova等[6]從5個(gè)土樣中分離出27株變形菌門(mén)（Proteobacteria）的抗砷菌，兼具氧化和還原能力；Chang等[7]從砷污染土壤中分離出Citrobacter sp.NC-1，24 h內(nèi)可將固相中的As（V）還原為具有更高遷移性的As（Ⅲ），與硫化物或亞鐵離子結(jié)合從而降低其移動(dòng)性。目前公認(rèn)的砷還原機(jī)制有兩種，包括呼吸和解毒機(jī)制[8]。As（V）進(jìn)入好氧砷還原菌后，在細(xì)胞內(nèi)被還原為As（Ⅲ）并排出體外，實(shí)現(xiàn)砷解毒作用。這一過(guò)程由染色體[9]或質(zhì)粒[10]編碼的ars操縱子調(diào)控，具體包括3～5個(gè)基因（arsR，-D，-A，-B，與-C）[11]。研究表明，好氧砷還原菌可以控制砷的遷移轉(zhuǎn)化，促進(jìn)沉積物中砷的釋放[7]。因此，好氧砷還原菌的多樣性及其在砷地球化學(xué)循環(huán)中的重要調(diào)控作用受到了廣泛關(guān)注。

對(duì)砷而言，蜈蚣草是一種理想的修復(fù)植物。但目前關(guān)于蜈蚣草砷富集研究主要集中于體內(nèi)砷還原酶及砷轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[12]，對(duì)微生物在蜈蚣草砷富集過(guò)程中的作用研究尚處于初始階段。已有研究表明，微生物在促進(jìn)蜈蚣草砷富集能力的同時(shí)，還可以提高蜈蚣草的生物量。Ghosh等[13]將根際菌與蜈蚣草共培養(yǎng)，提高了蜈蚣草對(duì)砷的攝入量（18.1～35.3 mg·kg-1），并且蜈蚣草的生物量有所增加[1.5～3.4 g（dw）]。Yang等[14]也有類似的發(fā)現(xiàn)，在添加砷還原菌后，蜈蚣草的生物量增加了53%，砷吸收量增加了44%。Han等[15]在加入抗砷菌之后，蜈蚣草的砷和磷吸收量分別增加了47%和69%，且生物量增加了20%～74%。蜈蚣草體內(nèi)及根際土壤中分布著大量的抗砷及砷還原菌，但是目前相關(guān)研究較少，且分離出的抗砷菌種類十分有限。

本文從蜈蚣草體內(nèi)及根際土壤中分離抗砷菌，以期不斷擴(kuò)充砷還原菌的種類，加強(qiáng)對(duì)砷還原菌群分布的認(rèn)識(shí)，并對(duì)其砷還原效率和機(jī)制進(jìn)行表征，進(jìn)一步探明它們?cè)诳股榧吧榈牡厍蚧瘜W(xué)循環(huán)中的重要作用，為砷污染土壤中的微生物-植物聯(lián)合修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蜈蚣草及其根際土壤采自湖南石門(mén)地區(qū)的雄黃尾砂礦區(qū)（29°38′55″N，111°01′46″E），其中蜈蚣草連根采集裝入樣品袋；振蕩除去粘附根系的松散土壤后，刮下緊緊粘附在根系的土壤作為根際土壤，保存于塑封袋中[16]；用大量自來(lái)水沖洗附著在植物樣品表面的塵土，最后用去離子水沖洗干凈備用。所有樣品存儲(chǔ)于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 抗砷菌的篩選和鑒定

1.2.1 抗砷菌的篩選

本試驗(yàn)選用4種培養(yǎng)基，分別為含20 mmol·L-1砷酸鈉的寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（BCM和YCM）與富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（TYEG和BPM），具體成分見(jiàn)表1。蜈蚣草內(nèi)生抗砷菌的分離方法如下：稱取3 g植物樣品，移入超凈工作臺(tái)后，用75%酒精消毒處理，并用手術(shù)刀剪碎至5 mm片段，充分研磨后[17]，再分別加入30 mL的4種培養(yǎng)基。

篩選根際土壤中抗砷菌時(shí)，稱3 g土樣分別加入30 mL的4種培養(yǎng)基。兩類菌均采取如下兩種培養(yǎng)方法。直接稀釋法：將混合培養(yǎng)物充分振蕩混勻后取1 mL液體進(jìn)行稀釋，吸取不同稀釋度的100 μL稀釋液進(jìn)行平板涂布。馴化法：將上述混合物于30℃、150 r·min-1下振蕩培養(yǎng)12 h，取樣品3 mL再次轉(zhuǎn)接入相同的無(wú)菌培養(yǎng)基中，重復(fù)3次后進(jìn)行平板涂布。通過(guò)劃線培養(yǎng)挑取單菌落，再轉(zhuǎn)接入相應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行二次劃線培養(yǎng)，挑取的單菌落保存至含30%甘油的培養(yǎng)基中，置于-80℃冰箱備用。

1.2.2 抗砷菌的16S rRNA鑒定

利用LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基對(duì)保存菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，10 000 r·min-1下離心10 min后收集菌體。采用細(xì)菌基因組試劑盒（Omega，美國(guó)）提取細(xì)菌總DNA后，PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf，德國(guó)）擴(kuò)增各菌株16S rRNA序列。所用引物為27F（5′-AGAGTT?GATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGT?TACCTTTTACGACTT-3′），隨后1×TAE-1%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。膠回收試劑盒（Omega，美國(guó)）回收PCR產(chǎn)物后，按常規(guī)步驟克隆后由擎科公司（北京，中國(guó)）進(jìn)行DNA測(cè)序，利用NCBI的BlastN程序進(jìn)行序列比對(duì)，確定鑒定結(jié)果。

表1 分離抗砷菌的培養(yǎng)基配方Table 1 The component of four mediums used in the isolation experiment

1.3 抗砷能力及還原基因鑒定

1.3.1 抗砷菌的As（Ⅴ）與As（Ⅲ）抗性

本試驗(yàn)采用最大生長(zhǎng)抑制濃度（Minimum inhibi?tory concentration，簡(jiǎn)稱MIC）來(lái)表征菌株的砷抗性[7]。具體方法如下：利用LB液體培養(yǎng)基對(duì)保存菌株進(jìn)行活化。同時(shí)配制50 mL含砷的LB液體培養(yǎng)基，As（Ⅴ）和 As（Ⅲ）的濃度分別為 0～500 mmol·L-1與 0～50 mmol·L-1。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液100 μL接入上述含砷培養(yǎng)基中，于150 r·min-1、30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，利用紫外分光光度計(jì)（HACH DR2800，美國(guó)）測(cè)定其OD600。

1.3.2 砷還原基因（arsB，arsC）鑒定

將保存菌株利用LB液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，離心收集菌體。用細(xì)菌基因組試劑盒（Omega，美國(guó)）提取其DNA，采用表2中引物擴(kuò)增目的基因片段。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物采用膠回收試劑盒（Omega，美國(guó)）回收，按常規(guī)步驟克隆后由擎科公司（北京，中國(guó)）進(jìn)行DNA測(cè)序，利用NCBI的BlastN程序進(jìn)行序列比對(duì)。

1.4 砷還原率及累積率測(cè)定

將保藏菌液接種于LB液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，取100 μL菌液于含1 mmol·L-1As（Ⅴ）的LB培養(yǎng)基中，150 r·min-1、30 ℃下培養(yǎng)24 h后，取1 mL混合培養(yǎng)液于5000 r·min-1離心5 min，收集上清液。同時(shí)設(shè)置無(wú)菌處理為對(duì)照。用高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀（HPLC-AFS）（吉天，中國(guó)）測(cè)定上清液中As（Ⅴ）與As（Ⅲ）的濃度，計(jì)算菌株的砷還原率與累積率。

表2 arsBC引物序列[18]Table 2 The primer sequences used in the detection of arsBC genes

還原率=（CAs（Ⅲ）/CT-As）×100%

累積率=（C0-CT-As/C0）×100%

式中：C0為初始砷濃度；CAs（Ⅲ）為加入菌株反應(yīng)24 h后的As（Ⅲ）濃度；CT-As為加入菌株反應(yīng)24 h后的總砷濃度。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)NCBI查詢并獲得構(gòu)建發(fā)育樹(shù)所需的參考序列。將所有序列通過(guò)Clustal X2程序編輯成相同片段長(zhǎng)度后，利用MEGA6.0軟件中的Neighbor_Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[19]。本研究所得DNA序列已全部提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)分別為MG759526～MG759548（16S rRNA）；MG765306～MG765326（arsC）及MG765327～MG765328（arsB）。

2 結(jié)果與分析

2.1 砷抗性菌分離和鑒定

從蜈蚣草體內(nèi)及根際土壤共篩選分離到23株砷抗性菌，結(jié)果見(jiàn)表3與表4。寡培養(yǎng)基和富培養(yǎng)基中分別獲得10、13株菌；馴化培養(yǎng)法和直接稀釋法各分離出13、10株抗性菌；而且18株和5株分別分離自根際土壤和蜈蚣草體內(nèi)。23株菌歸屬于兩個(gè)門(mén)：變形菌門(mén)（Proteobacteria，其中γ-Proteobacteria，16株；α-Proteobacteria，2株）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes，5株），涉及10個(gè)屬。其中13株菌來(lái)自假單胞菌屬（Pseudomo?nas）。

表3 23株抗砷菌的分離培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法Table 3 The culture media and methods used for 23arsenic-resistant strains

為確定抗砷菌的分類學(xué)地位，測(cè)定其16S rRNA序列，經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)所有抗砷菌與已報(bào)道模式菌的同源性高達(dá)99%。并對(duì)23株抗砷菌的16S rRNA構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1），表明所有假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）的菌株同源性高，親緣關(guān)系近，只存在種間差異；來(lái)自微小桿菌屬（Exiguobacteri?um sp.）的兩株菌S13和S17也存在類似關(guān)系。解糖假蒼白桿菌（Pseudochrobactrum sp.）和土壤桿菌（Agrobacterium sp.）不同屬序列之間也顯示了較高的一致性，這可能是因?yàn)樗鼈儊?lái)源于相距較近的類群。

2.2 砷抗性菌的抗性、還原率和累積率

23株抗性菌對(duì)As（Ⅴ）、As（Ⅲ）的耐受濃度截然不同，其濃度范圍分別為 80～150 mmol·L-1與 5～30 mmol·L-1（表5）。比較各個(gè)菌株對(duì)不同價(jià)態(tài)砷的抗性可以發(fā)現(xiàn)，其對(duì)As（Ⅴ）與As（Ⅲ）的抗性能力并未呈現(xiàn)出一致性。如菌株S4和P1對(duì)As（Ⅴ）和As（Ⅲ）抗性最高，而S16雖然可耐受30 mmol·L-1的As（Ⅲ），但其抗As（Ⅴ）能力相對(duì)較小，耐受濃度僅為80 mmol·L-1。

各菌株的砷還原及累積特性差異較大，砷還原率范圍為0%～100%，砷累積率為3%～79%。其中19株抗砷菌的砷還原率均低于20%，砷累積率低于50%。僅有4株菌（Pseudomonas sp.S2、Pseudomonas sp.P3、Staphylococcus sp.S14與Agrobacterium sp.P1）同時(shí)表現(xiàn)出較高的砷還原率（81%～100%）與累積率（75%～79%），表明這幾株菌在砷污染土壤的生物修復(fù)中具有較大的應(yīng)用潛力。

2.3 砷還原基因arsBC

對(duì)23株菌的arsBC基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，從21株菌可擴(kuò)增出arsC基因，而僅在2株菌中擴(kuò)增出arsB基因。綜合比較23株菌的砷抗性特征發(fā)現(xiàn)，arsC基因是抗砷菌中普遍存在的還原基因，但并非砷還原率及抗性的決定性因素。分別將21個(gè)arsC和2個(gè)arsB序列與GenBank中的參比序列比對(duì)，構(gòu)建相應(yīng)氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2和圖3）。結(jié)果表明，21株菌的arsC序列與已驗(yàn)證的砷還原酶arsC親緣關(guān)系較近。菌株S1、S15和S6在16S rRNA結(jié)果中顯示為不同屬（圖1），但其arsC基因的相似度高達(dá)99%，說(shuō)明arsC基因在進(jìn)化過(guò)程中可能保守性較高或存在相關(guān)的水平轉(zhuǎn)移。而arsB的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株S7和S14的arsB存在于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表4 23株抗砷菌16S rRNA的鑒定結(jié)果Table 4 16S rRNA identification of 23 arsenic-resistant bacteria

3 討論

3.1 抗砷菌的多樣性

本研究共篩選獲得來(lái)自10個(gè)屬的23株抗砷菌，其中5個(gè)屬（Pseudomonas、Acinetobacter、Exiguobacteri?um、Bacillus與Lysinibacillus）在其他眾多文獻(xiàn)中被報(bào)道為抗砷菌[18，20-21]。不同于以往的研究中僅選用單一培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法[22]，本研究同時(shí)采用了4種培養(yǎng)基及2種培養(yǎng)方法篩選蜈蚣草體內(nèi)及根際土壤抗砷菌，獲得比以往研究更為豐富的菌種資源。富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（TYEG與BPM）與馴化培養(yǎng)法在篩選抗砷菌方面稍顯優(yōu)勢(shì)（表3），在未來(lái)的抗砷菌分離中可優(yōu)先采用。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬（Pseudomonas）是抗砷菌的重要來(lái)源，這與前人研究結(jié)果相近。如Krumova等[6]在研究中分離出27株抗砷菌，其中20株都來(lái)自假單胞菌屬；Ghosh等[13]從蜈蚣草根際土壤中分離到7株菌，其中5株來(lái)自假單胞菌屬。而侯運(yùn)楠、潘建華等[23-24]對(duì)該5個(gè)屬的重金屬抗性研究中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)外界環(huán)境表現(xiàn)出極強(qiáng)的適應(yīng)力，因此廣泛擁有抗砷能力可能是這些微生物適應(yīng)惡劣環(huán)境的表現(xiàn)之一。而針對(duì)其他5個(gè)屬（Cedecea、Pseudochrobactrum、Staphylo?coccus、Stenotrophomonas與 Agrobacterium），則鮮有報(bào)道其為抗砷菌。

表5 抗砷菌的抗性能力、抗性基因、還原率及累積率Table 5 Arsenic resistance，ars genes，reduction and accumulation rate of resistant strains

從不同分離來(lái)源來(lái)看，本研究中18株菌分離自根際土壤，僅5株菌為蜈蚣草內(nèi)生菌，而Han等[25]從蜈蚣草中分離的根際菌和內(nèi)生菌數(shù)量比達(dá)到17∶20。兩者差異性可能來(lái)自于篩選培養(yǎng)基中的砷脅迫濃度不一致。Han等[25]在分離抗砷菌的培養(yǎng)基中添加的砷濃度僅為75 mg·L-1，而本文中為了研究高抗性的砷還原菌，所添加的砷濃度為20 mmol·L-1。此外，分離結(jié)果顯示67%的根際抗砷菌來(lái)源于變形菌門(mén)（Proteo?bacteria），其中61%屬于γ-變形菌綱（γ-Proteobacte?ria），其余 33%來(lái)源于厚壁菌門(mén)（Firmicutes），這與Huang等[26]的研究結(jié)果一致，他們同樣發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱是抗砷菌的主要來(lái)源（84%）。但Han等[27]的研究卻發(fā)現(xiàn)α-變形菌綱（α-Proteobacteria）和β-變形菌綱（β-Proteobacteria）占所分離抗砷菌的80%，并且微生物群落結(jié)構(gòu)組成主要取決于土壤有機(jī)質(zhì)含量而非砷含量。因此，可以推斷抗砷菌主要來(lái)源的差異可能由分離土壤的性質(zhì)差異引起的。另一方面發(fā)現(xiàn)5株蜈蚣草內(nèi)生菌全部來(lái)自變形菌門(mén)，這與前人研究結(jié)果也存在一定差異性，如Zhu等[28]從蜈蚣草中分離的內(nèi)生菌全部歸屬于厚壁菌門(mén)。Rajendran等[29]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌的不同歸屬同樣與土壤的性質(zhì)密切相關(guān)，認(rèn)為植物組織的內(nèi)生菌可能來(lái)源于植物根際，并由此進(jìn)入植物組織的內(nèi)部，而植物根部長(zhǎng)時(shí)間與土壤接觸，因此土壤的性質(zhì)差異也會(huì)間接影響植物內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)。

圖2 arsC氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree constructed from arsC amino acid sequences of 21 As（Ⅴ）-resistant bacteria

3.2 高效砷還原菌的砷還原及累積特性

目前對(duì)好氧砷還原菌株已有很多報(bào)道，但對(duì)高效砷累積菌株研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)4株菌：Pseudomo?nas sp.S2、Pseudomonas sp.P3、Staphylococcus sp.S14和Agrobacterium sp.P1除了具有高效的砷還原能力，還可累積75%以上的砷（1 mmol·L-1），遠(yuǎn)高于其他砷累積菌株。Majumder等[30]發(fā)現(xiàn)Bacillus sp.HGH-21在25 mg·L-1的As（Ⅴ）濃度中培養(yǎng)3 d后的累積率僅為25.6%。Takeuchi等[31]發(fā)現(xiàn)M.communis在含5 mg·L-1的 As（Ⅴ）培養(yǎng)基中，可積累 2290 μg·g-1As。因此，基于這4株菌表現(xiàn)出的高累積能力，有必要深入探究其累積部位、形態(tài)及機(jī)理，以及與砷濃度、培養(yǎng)時(shí)間等的關(guān)系，優(yōu)化其累積效率并將其應(yīng)用于砷的生物修復(fù)。

圖3 arsB氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree constructed from arsB amino acid sequences of 2 As（Ⅴ）-resistant bacteria

以往研究發(fā)現(xiàn)砷還原菌的還原能力與砷抗性有關(guān)。Zhu等[28]發(fā)現(xiàn)，在1 mmol·L-1As（Ⅴ）條件下，砷還原能力與抗性呈負(fù)相關(guān)，而在10 mmol·L-1As（Ⅴ）濃度下，砷還原能力與抗性呈顯著正相關(guān)。而在本研究中，菌株砷抗性在任何濃度下都并未與砷還原率呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，可能是由于這些長(zhǎng)期處于砷污染環(huán)境中的土著細(xì)菌，為了保護(hù)細(xì)胞免于毒害，表達(dá)出了特異性蛋白并與砷結(jié)合，降低了砷的毒性，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的抗砷性[12]。另外，Chen等[32]發(fā)現(xiàn)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和有機(jī)砷化物外排透性酶（arsJ）共同作用也可將As（V）外排。Zhu等[33]發(fā)現(xiàn)arsN表達(dá)出一種類似乙?；D(zhuǎn)移酶的蛋白影響砷抗性。Bacillus sp.CDB3編碼的5種蛋白（arsR3TO1O2N）也與砷抗性有關(guān)[34]。另一方面，菌株砷還原能力很大程度上并不依賴于arsC基因的表達(dá)。本研究雖在21株菌中擴(kuò)增出arsC基因，但并非均表現(xiàn)出還原功能，因此砷還原能力與相關(guān)基因之間可能存在的關(guān)系還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

（1）本研究從蜈蚣草內(nèi)及其根際土壤中共分離到23株砷抗性菌，涉及2個(gè)門(mén)，10個(gè)屬，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）為優(yōu)勢(shì)菌群。

（2）在23株砷抗性菌中，4株菌被鑒定為高效砷還原及累積菌，砷還原率和累積率分別達(dá)到81%以上和75%以上。

（3）從21株抗砷菌中檢測(cè)到arsC還原基因，而僅從2株菌中擴(kuò)增出arsB基因，關(guān)于砷還原能力與基因表達(dá)之間的關(guān)系有待進(jìn)一步探究。