冷等離子體種子處理對(duì)銅脅迫下小麥種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的影響

鄧 敏，趙 玲，滕 應(yīng)*，劉 方，徐勇峰，3，任文杰，孟 珂，3，馬文亭

（1.貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽 550025；2.中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京土壤研究所，南京 210008；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

目前，我國(guó)農(nóng)田土壤重金屬污染嚴(yán)重[1]，其中銅（Cu）是我國(guó)《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》[2]列出的8個(gè)重金屬污染元素之一。Cu離子具有易遷移性、高蓄積性、持久性等特點(diǎn)[3]，易于通過食物鏈的生物放大給人類及其他動(dòng)物健康帶來潛在危害[4-5]。2014年《全國(guó)土壤污染調(diào)查公報(bào)》公布了我國(guó)土壤中Cu的點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)到2.1%[6]。Cu在土壤中的正常含量一般在20～30 mg·kg-1之間，但是在污染嚴(yán)重的地區(qū)，如銅礦區(qū)附近[7]，Cu濃度超過了5000 mg·kg-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2]。Cu雖然是植物體內(nèi)許多關(guān)鍵酶的輔基，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一[8-10]，但是過量的Cu會(huì)抑制根系生長(zhǎng)，對(duì)植物萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)造成影響[11]。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度Cu（≤50 mg·L-1）可促進(jìn)小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)[12]，而高于50 mg·L-1時(shí)[13]，根的生長(zhǎng)會(huì)受到明顯的抑制，更高濃度（300～500 mg·L-1）時(shí)，根的生長(zhǎng)只停留在瘤狀物階段，呈黑色或焦黃。通常，Cu離子主要積累在植物的根系，不易向地上部分轉(zhuǎn)移。因此，Cu含量過高時(shí)，植物首先受損的是根系，最嚴(yán)重的也是根系[8]。

小麥作為我國(guó)重要糧食作物，種子萌發(fā)時(shí)期幼苗的生長(zhǎng)狀況對(duì)作物生長(zhǎng)及產(chǎn)量有重要的影響[14]，因而提高小麥種子在萌發(fā)時(shí)期對(duì)重金屬的耐受性，緩解重金屬對(duì)小麥種子萌發(fā)時(shí)期的毒害作用就顯得尤為重要。傳統(tǒng)的種子處理技術(shù)有γ射線、激光、電場(chǎng)、磁場(chǎng)等[15-21]，但上述物理源在實(shí)際應(yīng)用過程中，還存在一定的局限性，如設(shè)備要求高或?qū)Νh(huán)境造成一定的污染等。因此有必要探索一種新的種子處理技術(shù)，以適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)需求。

冷等離子體種子處理技術(shù)是近年來國(guó)際上發(fā)展的一種新型種子處理技術(shù)[22]。與傳統(tǒng)種子處理技術(shù)相比，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、處理成本低，且對(duì)環(huán)境無污染，具有非常高的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值[23-24]。經(jīng)冷等離子體種子處理后的作物種子，其發(fā)芽率、幼苗生長(zhǎng)都有顯著提高[25]，能夠達(dá)到增產(chǎn)的目的[26-27]，并且能增強(qiáng)作物在抗旱、抗凍及耐鹽等方面的抗逆性[28]。但迄今為止，冷等離子體種子處理技術(shù)應(yīng)用于提高作物抗重金屬脅迫下種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的研究還未見報(bào)道。因此，本文以3個(gè)品種的小麥種子為研究對(duì)象，研究不同功率的冷等離子種子處理對(duì)小麥種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)抗重金屬Cu脅迫能力的影響，以期為冷等離子體種子處理技術(shù)用于提高重金屬污染農(nóng)田的安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試小麥品種蘇麥188、寧麥15、蘇麥128均購(gòu)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。CuSO4·5H2O（分析純）購(gòu)于上海金山亭新化工試劑廠。一次性塑料發(fā)芽盒規(guī)格為12 cm×12 cm×5 cm。

1.2 冷等離子體處理裝置

本研究采用次大氣輝光放電處理機(jī)（HPD-2400）對(duì)3種小麥種子進(jìn)行處理，其放電原理如圖1所示。

圖1 冷等離子體放電原理Figure 1 The principle of cold plasma discharge

1.3 冷等離子體處理方法

冷等離子體種子處理功率分別為：250、500、750、990 W，處理時(shí)長(zhǎng)為180 s[29-30]，以未經(jīng)過冷等離子體處理的種子作為對(duì)照（CK）。參照魯先文等[12]的報(bào)道，Cu脅迫濃度設(shè)為10、50、200 mg·L-1，分別代表低、中、高3個(gè)濃度。

1.4 萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)參照國(guó)家農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)（GB/T 3543.4—1995）[31]進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。具體操作：每個(gè)發(fā)苗盒鋪設(shè)兩層濾紙，加入不同濃度的CuSO4溶液，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻擺放50粒種子，置于（25±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)苗，每天觀測(cè)并統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)苗數(shù)（以胚苗長(zhǎng)度達(dá)到種子長(zhǎng)度一半為種子萌發(fā)的判斷標(biāo)準(zhǔn)）。每天加蒸餾水1 mL，保證水分充分供應(yīng)，培養(yǎng)到第7 d，測(cè)定其根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)等數(shù)值。

1.5 觀測(cè)項(xiàng)目及測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 發(fā)苗特性[32]

（1）發(fā)芽率G=7 d發(fā)苗種子數(shù)/供實(shí)驗(yàn)種子數(shù)×100%。

（2）發(fā)芽指數(shù)Gi=∑（Gt/Dt）

式中：Gt為t日的發(fā)苗數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)苗天數(shù)。

（3）活力指數(shù)VI=發(fā)芽指數(shù)×總長(zhǎng)。

（4）根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)。

1.5.2 幼苗根、苗Cu含量測(cè)定[33]

本次實(shí)驗(yàn)采用濕式消解法消解：將小麥連根取出，先用自來水沖冼干凈，然后用蒸餾水沖掉表面的自來水，用剪刀將根部與苗部分開，用濾紙吸干水分，在75℃條件下烘干至恒重。在研缽中分別將根、苗磨碎，用分析天平準(zhǔn)確稱取0.200 0 g上述處理后的樣品，分別裝入消解管中，然后向每個(gè)消解管中加入濃硝酸2.4 mL、過氧化氫0.8 mL，放入105℃烘箱中消解6 h。消解完成后，轉(zhuǎn)移并定容到15 mL，然后用一次性注射器和0.45 μm濾膜過濾，將過濾后的溶液用ICP-MS測(cè)定其中Cu的含量。每組樣品均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

重金屬Cu轉(zhuǎn)移系數(shù)和富集系數(shù)的計(jì)算公式[34]為：

轉(zhuǎn)移系數(shù)=根部含量（mg·kg-1）/苗部含量（mg·kg-1）

富集系數(shù)=植物體含量（mg·kg-1）/溶液中含量（mg·kg-1）

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行ANO?VA統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD（L）和Duncan（D）法進(jìn)行方差和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 冷等離子處理對(duì)Cu脅迫下小麥種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的影響

圖2反映了冷等離子處理對(duì)不同Cu濃度作用下蘇麥188、寧麥15、蘇麥128種子發(fā)芽率的影響。在相同冷等離子體處理?xiàng)l件下，Cu濃度從10 mg·L-1增加到200 mg·L-1時(shí)，蘇麥188、蘇麥128種子發(fā)芽率變化不顯著，而寧麥15種子的發(fā)芽率整體上受到了一定的抑制，最大降幅為8.5%。冷等離子體種子處理對(duì)Cu脅迫下小麥種子發(fā)芽有一定的促進(jìn)作用，但整體促進(jìn)作用不大。

當(dāng)Cu濃度為10、50 mg·L-1時(shí)，種子經(jīng)250 W冷等離子體處理后，相比對(duì)照處理，蘇麥188的發(fā)芽率有一定提高，增幅分別為3.0%和5.6%，達(dá)到了顯著差異水平；經(jīng)500 W冷等離子體處理后，寧麥15的發(fā)芽率相比對(duì)照提高了4.6%和4.7%，且呈現(xiàn)出顯著性差異。

圖2 冷等離子處理對(duì)Cu脅迫下3種小麥種子發(fā)芽率的影響Figure 2 Effects of cold plasma treatment on the germination rate of three wheat seeds under Cu stresses

在相同處理功率下，不同品種的小麥在Cu脅迫下的發(fā)芽率存在一定的差異。250 W的冷等離子體處理整體上對(duì)蘇麥188的發(fā)芽率有一定提高，但對(duì)寧麥15、蘇麥128的發(fā)芽率影響不大，甚至產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。同樣，500 W的冷等離子體處理對(duì)寧麥15的發(fā)芽率有一定提高，但對(duì)其他兩個(gè)品種小麥的發(fā)芽無影響。

圖3 冷等離子處理對(duì)Cu脅迫下3種小麥種子發(fā)芽指數(shù)的影響Figure 3 Effects of cold plasma treatment on the germination index of three wheat seeds under Cu stresses

冷等離子體處理對(duì)不同Cu濃度作用下蘇麥188、寧麥15、蘇麥128種子發(fā)芽指數(shù)的影響見圖3。在相同等離子體處理?xiàng)l件下，隨著Cu脅迫濃度的增加，小麥種子的發(fā)芽指數(shù)呈下降的趨勢(shì)，在200 mg·L-1Cu脅迫下的寧麥15發(fā)芽指數(shù)較10 mg·L-1時(shí)Cu脅迫下降幅最大為12.5%。

種子經(jīng)990 W冷等離子體處理后，相比對(duì)照處理，10 mg·L-1Cu處理下蘇麥188和寧麥15的發(fā)芽指數(shù)有一定的提高，增幅分別為10.2%和10.3%；但是對(duì)中高濃度Cu脅迫下的小麥發(fā)芽指數(shù)幾乎無影響。其他冷等離子體處理功率對(duì)不同Cu脅迫下3種小麥發(fā)芽指數(shù)的影響也不顯著。整體而言，冷等離子體種子處理對(duì)Cu脅迫下的小麥發(fā)芽指數(shù)影響不顯著。

2.2 冷等離子體處理對(duì)Cu脅迫下小麥根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)的影響

冷等離子體處理對(duì)Cu脅迫下蘇麥188、寧麥15和蘇麥128根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)的影響如圖4所示。在對(duì)照處理中，Cu脅迫濃度越高，小麥根、苗生長(zhǎng)受到的限制作用越明顯，與10 mg·L-1Cu脅迫濃度的結(jié)果相比，高濃度200 mg·L-1Cu作用下小麥根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)的降幅最大，分別為37.4%和54.8%。

冷等離子體處理對(duì)Cu脅迫下小麥的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用：當(dāng)Cu脅迫濃度為10 mg·L-1時(shí)，與對(duì)照相比，500 W處理下寧麥15根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)分別提高了46.2%和37.1%。當(dāng)Cu脅迫濃度為50 mg·L-1時(shí)，同樣，500 W的處理對(duì)蘇麥188、寧麥15的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)都有明顯的促進(jìn)作用，其中蘇麥188的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)分別增加了18.5%和4.7%，而寧麥15的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)分別增加了15.1%和75.5%；250 W處理下蘇麥128的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)分別提高了19.3%和145.4%。當(dāng)Cu脅迫濃度達(dá)200 mg·L-1時(shí)，不同功率的冷等離子體處理對(duì)3種小麥的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)的促進(jìn)效果都很顯著，其中250 W的處理對(duì)蘇麥128的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)分別提高了15.1%和29.1%；500 W處理下蘇麥188根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)分別提高了20.0%和99.0%，寧麥15的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)也有19.2%和19.4%的提高。這表明適宜功率的冷等離子體處理對(duì)不同Cu脅迫濃度下的小麥幼苗生長(zhǎng)均起到了明顯的促進(jìn)作用。

在相同的處理功率下，不同品種的小麥在Cu脅迫下的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)存在一定的差異。500 W的冷等離子體處理下蘇麥188、寧麥15的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)均有顯著提高，但對(duì)蘇麥128的影響不顯著。同樣，250 W的冷等離子體處理下蘇麥128的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)有明顯提高，但對(duì)其他兩個(gè)品種根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)的影響不明顯。說明不同品種的小麥適宜的冷等離子體功率不同。

2.3 冷等離子體處理對(duì)Cu脅迫下小麥活力指數(shù)的影響

圖5為冷等離子體處理對(duì)Cu脅迫下蘇麥188、寧麥15、蘇麥128活力指數(shù)的影響。在對(duì)照處理下，Cu脅迫濃度越高，小麥的活力指數(shù)下降得越明顯：50 mg·L-1Cu脅迫與10 mg·L-1Cu脅迫相比，蘇麥188、寧麥15和蘇麥128的活力指數(shù)分別下降了47.9%、46.4%和53.9%；而在200 mg·L-1Cu脅迫下，活力指數(shù)下降幅度更加明顯，分別為69.5%、59.3%和66.6%。

圖4 冷等離子處理對(duì)Cu脅迫下小麥種子根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)的影響Figure 4 Effects of cold plasma treatment on roots and sprouts of wheat under Cu stresses

圖5 冷等離子處理對(duì)Cu脅迫下小麥種子活力指數(shù)的影響Figure 5 Effects of cold plasma treatment on vigor index of wheat under Cu stresses

冷等離子體處理提高了不同Cu脅迫濃度下3種小麥種子的活力指數(shù)：當(dāng)Cu濃度為10 mg·L-1時(shí)，與對(duì)照處理相比，500 W處理下寧麥15的活力指數(shù)提高了49.0%；當(dāng)Cu脅迫濃度為50 mg·L-1時(shí)，500 W的處理使蘇麥188、寧麥15的活力指數(shù)分別增加了12.4%和64.6%，而250 W處理下蘇麥128的活力指數(shù)提高了82.1%；當(dāng)Cu脅迫濃度達(dá)200 mg·L-1時(shí)，相比于對(duì)照處理，500 W的處理使蘇麥188、寧麥15的活力指數(shù)分別增加了42.7%、19.4%，而250 W的處理使蘇麥128的活力指數(shù)增加了38.0%。由此可見，適宜功率的冷等離子體處理能增強(qiáng)不同Cu脅迫濃度下小麥種子的活力指數(shù)。

在相同的處理功率下，不同品種的小麥在Cu脅迫下的活力指數(shù)存在一定的差異。500 W的冷等離子體處理對(duì)蘇麥188、寧麥15的活力指數(shù)均有顯著提高，但對(duì)蘇麥128的影響不明顯，甚至產(chǎn)生負(fù)作用。同樣，250 W的冷等離子體處理對(duì)蘇麥128的活力指數(shù)有顯著提高，但對(duì)其他兩個(gè)品種影響不明顯。

2.4 冷等離子體處理對(duì)小麥幼苗根、苗Cu富集的影響

表1為冷等離子體處理對(duì)小麥幼苗根、苗中Cu富集特征的影響。從表1可以看出：無論是對(duì)照處理還是冷等離子體處理，隨著Cu脅迫濃度增加，3種小麥幼苗根、苗中的Cu含量均有不同程度地升高，且Cu的富集系數(shù)均表現(xiàn)為根＞苗。同時(shí)，與對(duì)照處理相比，在Cu脅迫濃度為10 mg·L-1和50 mg·L-1時(shí)，冷等離子體處理整體上促進(jìn)了根、苗對(duì)Cu的吸收，最高增幅分別達(dá)到了111.1%和26.3%；在Cu脅迫濃度為200 mg·L-1時(shí)，冷等離子體處理對(duì)Cu的吸收既有促進(jìn)也有抑制，表現(xiàn)出不確定性；但是不同品種的小麥幼苗對(duì)Cu的轉(zhuǎn)移系數(shù)卻都呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，其中蘇麥188和寧麥15的升幅較明顯，而蘇麥128的升幅不顯著。由此可見，在低濃度Cu脅迫時(shí)，冷等離子體處理能夠促進(jìn)根和苗對(duì)Cu的吸收；在高濃度Cu脅迫時(shí)，冷等離子體處理在一定程度上提高了幼苗將根部的Cu轉(zhuǎn)運(yùn)到苗部的能力，從而減輕了Cu對(duì)根部的毒害作用。

表1 冷等離子體處理對(duì)小麥幼苗根、苗中Cu富集的影響Table 1 The effect of cold plasma treatment on the accumulation of copper in the root and seedling of wheat seeds

3 討論

由于Cu是植物體內(nèi)許多關(guān)鍵酶的輔基，是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，因此，低劑量的Cu脅迫能夠促進(jìn)植物體內(nèi)酶的合成，維持植物的正常新陳代謝[35]。但是，高濃度Cu脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有明顯的抑制及毒害作用，例如抑制小麥的萌發(fā)、生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂與酶活性，進(jìn)而影響小麥的光合作用和呼吸作用[36]。本研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，即高濃度Cu存在時(shí)可明顯抑制小麥種子的萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)。而采用適宜功率冷等離子體處理雖然不能明顯提高Cu脅迫作用下不同小麥種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，但在一定程度上提高了小麥種子的活力指數(shù)，促進(jìn)了小麥幼苗的生長(zhǎng)，例如本研究結(jié)果呈現(xiàn)的小麥根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)和活力指數(shù)較對(duì)照處理組的最大增幅分別為46.2%、145.4%和82.1%（圖4和圖5），這與報(bào)道的等離子體促進(jìn)常規(guī)萌發(fā)條件下小麥種子萌發(fā)生長(zhǎng)的結(jié)果類似[37-38]。據(jù)報(bào)道，冷等離子體處理可以提高種子中過氧化物酶、α-淀粉酶、琥珀酸脫氧酶等酶的活性，使種子呼吸作用增強(qiáng)，生物氧化過程加快，物質(zhì)的合成與運(yùn)輸能力加速進(jìn)行[39]，這可能也是本研究中冷等離子體處理增強(qiáng)小麥種子抗Cu脅迫作用的原因。

冷等離子體處理對(duì)種子萌發(fā)與作物生長(zhǎng)影響的機(jī)制尚未完全清晰，Li等[40]從水分的吸收和酶活性等角度進(jìn)行了探索。本研究從重金屬吸收的角度對(duì)冷等離子體的作用機(jī)理進(jìn)行了初步探索，在低濃度Cu作用時(shí)，冷等離子體在一定程度上能夠促進(jìn)根、苗對(duì)Cu的吸收，提高種子活力，Cu可參與到幼苗的生理生長(zhǎng)過程中，對(duì)幼苗早期的生長(zhǎng)發(fā)育起到了積極作用[41]；在高濃度Cu作用時(shí)，冷等離子體能夠提高幼苗對(duì)Cu的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，在一定程度上減輕了Cu對(duì)幼苗根部的毒害作用，從而促進(jìn)了幼苗生長(zhǎng)。

從不同功率冷等離子體處理的結(jié)果可以看出，不同小麥品種對(duì)冷等離子體的敏感性及耐受性存在明顯差異。因此，該技術(shù)在今后實(shí)際應(yīng)用時(shí)，需要根據(jù)作物品種確定適宜的冷等離子體功率。

4 結(jié)論

（1）隨著Cu脅迫濃度的增加，未作冷等離子體處理的3種小麥種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，冷等離子體種子處理可以有效緩解這種抑制作用。

（2）冷等離子處理對(duì)小麥在Cu脅迫作用下的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)影響不大，但是對(duì)根、苗的生長(zhǎng)以及種子活力指數(shù)均有一定的提高。

（3）低濃度Cu脅迫下，冷等離子體能夠促進(jìn)幼苗對(duì)Cu的吸收，提高種子的活力；高濃度Cu脅迫時(shí)，冷等離子體處理能在一定程度上提高幼苗將根部的Cu轉(zhuǎn)運(yùn)到苗部的能力，減輕Cu對(duì)幼苗根部的毒害作用，從而促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)。