光甘草定對大鼠對比劑急性腎損傷的保護作用及其主要機制研究*

劉巨旗 朱藝欣，2

（1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院東關(guān)分院，陜西 延安 716000；2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院東關(guān)心腦血管病專科醫(yī)院，陜西 延安 716000）

隨著臨床冠脈介入及血管造影技術(shù)的迅速發(fā)展，對比劑的使用范圍越來越廣泛，由此造成的各種不良反應(yīng)發(fā)生率亦明顯增高，其中對比劑急性腎損傷是對比劑最常見的不良反應(yīng)，不僅增加患者醫(yī)療負(fù)擔(dān)、影響患者病情恢復(fù)，還可引發(fā)醫(yī)院獲得性腎功能衰竭，對患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅［1-2］。研究結(jié)果表明，對比劑所致機體活性氧合成增多，引起的氧化應(yīng)激損傷是造成對比劑急性腎損傷的主要因素，而目前臨床針對該類型腎損傷的治療并無權(quán)威方法，且對其新藥研發(fā)亦尚屬起步階段，因此如何有效治療對比劑所致急性腎損傷是臨床迫切需要解決的重大課題［3-4］。光甘草定是一種提取自光果甘草（Glycyrrhiza glabraL.）的天然藥物，具有較強的抗氧化、抗炎及抗菌活性［5］。為此，本研究旨在觀察光甘草定對大鼠對比劑急性腎損傷的保護作用，并對其作用機制進行探討，期望為該藥物的臨床新應(yīng)用及對比劑急性腎損傷的臨床治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔級雌性Spague-Dawlay（SD）大鼠 50只，體質(zhì)量 180～210 g，周齡 9～11周，由北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供并由該中心代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，飲食不限、日常光照、55%濕度、自由飲水及室溫等，動物合格證編號：SCXK（京）2017-0321。

1.2 試藥與儀器 光甘草定（美國Sigma公司；批號12889570），優(yōu)維顯碘普羅胺（美國Sigma公司；批號90982107；滲透壓 774mOsm/kg H2O；碘含量 370 mg/mL）。血紅素加氧酶（HO-1）、過氧化氫酶（CAT）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHDG）及髓過氧化物酶（MPO）熒光免疫組化染色所需抗體及試劑盒（美國Sigma公司，批號分別為 98009821、98110923、98092341 及 98109394）；多聚甲醛及蘇木精-伊紅（HE）染色所需染色液均購自武漢古河生物科技有限公司。HN-89型光學(xué)顯微鏡（日本奧林匹斯公司）；QU-20型全自動血液生化儀（美國貝克曼公司）；R-8型切片機（德國安得寶科技公司）；C-9型全自動酶標(biāo)儀 （美國BIO-TEK公司）；BN-09S型紫外分光光度計（上海觀科分光儀有限公司）；TB-718型生物組織包埋機 （武漢安達科技實業(yè)有限公司）；HM325型石蠟切片機（德國米克公司）。

1.3 造模與干預(yù) 大鼠均進行7 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機分為空白組、模型組、光甘草定高劑量組、光甘草定中劑量組及光甘草定低劑量組，每組10只。采用優(yōu)維顯碘普羅胺（注射劑量10 mg/kg）尾靜脈注射法［6］對除空白組外其余各組小鼠進行造模，注射后1 h，對各組大鼠進行灌胃給藥處理，其中光甘草定高劑量組、中劑量組及低劑量組大鼠分別給予200、100、50 mg/kg的光甘草定，空白組及模型組則均灌胃給予等量（0.2 mL）生理鹽水，連續(xù)給藥3 d。

1.4 標(biāo)本采集及檢測 1）末次灌胃24 h后，采用尾靜脈取血法取各組大鼠靜脈血，檢測其中血肌酐（Scr）及尿素氮（BUN）等腎功能指標(biāo)含量。2）取血后將各組大鼠處死，解剖并取雙側(cè)腎。利用多聚甲醛（pH=7.4）將左側(cè)腎臟腎小管部位固定保存，經(jīng)過石蠟包埋、HE染色、切片、烤片與封片處理后觀察其病理組織學(xué)變化。3）將右側(cè)腎臟腎小管部位平均分成4份，依次進行切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、一抗結(jié)合、二抗結(jié)合、復(fù)染及封片處理，采用熒光免疫組化法觀察其中HO-1、CAT、8-OHDG及MPO的表達情況，陽性表達為橙紅色，并采用Image-proplus 6.0圖像分析軟件統(tǒng)計上述蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析對組間進行比較，兩兩比較則采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎臟功能指標(biāo)比較 見表1。與空白組比較，模型組、光甘草定高劑量組、中劑量組及低劑量組大鼠血清中Scr及BUN均明顯增高（P<0.05）。與模型組比較，光甘草定高劑量組、中劑量組及低劑量組大鼠血清中Scr及BUN均明顯降低（P<0.05）。與中劑量組及低劑量組比，光甘草定高劑量組Scr及BUN均明顯降低（P<0.05）。與低劑量組比，光甘草定中劑量組Scr及BUN均明顯降低（P<0.05）。

表1 各組大鼠腎臟功能指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠腎臟功能指標(biāo)比較（±s）

與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與光甘草定中劑量組比較，◇P＜0.05；與光甘草定低劑量組比較，☆P＜0.05。下同

組 別 n S c r（μ m o l/L） B U N（m m o l/L）空白組 1 0 1 2.2 4±1.2 7* 3.5 6±0.3 2*模型組 1 0 4 4.7 8±4.4 1△ 1 4.4 5±1.4 1△光甘草定高劑量組 1 0 2 4.4 5±2.4 0*△◇☆ 5.6 7±0.5 1*△◇☆光甘草定中劑量組 1 0 2 9.0 2±2.9 1*△☆ 7.1 2±0.7 0*△☆光甘草定低劑量組 1 0 3 2.7 6±3.2 9*△◇ 1 0.1 7±1.0 1*△◇

2.2 各組大鼠病理組織學(xué)比較 見圖1。HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠中可見大量腎小球內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、空泡及變性，腎小管結(jié)構(gòu)破壞，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞呈刷狀緣脫落；空白組大鼠中腎小球內(nèi)皮細(xì)胞未出現(xiàn)明顯損傷、腎小管結(jié)構(gòu)正常；光甘草定高劑量組、中劑量組及低劑量組大鼠呈現(xiàn)不同程度腎小球內(nèi)皮細(xì)胞變性、腎小管結(jié)構(gòu)破壞及腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，但程度均不及模型組。

圖1 各組大鼠腎臟病理組織學(xué)比較（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)表達情況比較 見圖2～圖5。 熒光免疫組化染色中，HO-1、CAT、8-OHDG及MPO陽性表達均呈橙紅色彌漫狀或顆粒狀分布。結(jié)果表明，模型組大鼠腎組織中HO-1及CAT均呈弱表達或無明顯表達，而8-OHDG及MPO則呈強陽性表達；空白組大鼠腎組織中HO-1及CAT均呈強陽性表達表達，而8-OHDG及MPO則均呈弱表達或無明顯表達；光甘草定高劑量組、中劑量組及低劑量組大鼠腎組織中HO-1及CAT陽性表達情況明確強于模型組，而8-OHDG及MPO陽性表達情況明確弱于模型組。

半定量分析結(jié)果表明，與空白組比較，模型組、光甘草定高劑量組、中劑量組及低劑量組HO-1及CAT相對表達量均明顯降低，而8-OHDG及MPO相對表達量均明顯增高（P<0.05）。與模型組比較，光甘草定高劑量組、中劑量組及低劑量組HO-1及CAT相對表達量均明顯增高，而8-OHDG及MPO相對表達量均明顯降低（P<0.05）。與中劑量組及低劑量組比，光甘草定高劑量組HO-1及CAT相對表達量均明顯增高，而8-OHDG及MPO相對表達量均明顯降低（P<0.05）。與低劑量組比，光甘草定中劑量組HO-1及CAT相對表達量均明顯增高，而8-OHDG及MPO相對表達量均明顯降低（P<0.05）。見表2。

圖3 各組腎組織中CAT表達情況（免疫熒光染色，400倍）

圖4 各組腎組織中8-OHDG表達情況（免疫熒光染色，400倍）

圖5 各組腎組織中MPO表達情況（免疫熒光染色，400倍）

3 討 論

隨著現(xiàn)代介入心臟病學(xué)及醫(yī)學(xué)影像的迅速發(fā)展，越來越多患者在臨床診斷及治療中使用對比劑，而由此所引發(fā)的對比劑急性腎損傷已成為造成醫(yī)院獲得性腎功能衰竭主要原因之一［7］。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，盡管對比劑急性腎損傷在普通人群的發(fā)生率不足2%，但在慢性腎炎、慢性腎衰竭及糖尿病等高危人群中的發(fā)生率高達50%以上，且對比劑急性腎損傷亦是增加冠狀動脈介入診療術(shù)患者死亡率的獨立危險因素之一，嚴(yán)重威脅廣大患者的生命健康［8-9］。

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)熒光免疫組化相對表達量比較（±s）

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)熒光免疫組化相對表達量比較（±s）

組 別 n空白組 1 0模型組 1 0光甘草定高劑量組 1 0 H O-1 C A T 8-O H D G M P O 1 0 0.0 0±0.0 0* 1 0 0.0 0±0.0 0* 1 0 0.0 0±0.0 0* 1 0 0.0 0±0.0 0*2 1.4 5±2.1 2△ 1 5.4 5±1.5 2△ 1 5 5 2.5 7±1 5 5.7 1△ 1 6 7 2.3 4±1 6 6.3 5△7 1.7 8±7.2 6*△◇☆ 7 8.4 2±7.7 4*△◇☆ 2 9 6.2 1±1 2.7 8*△◇☆ 5 2 2.5 6±6 1.2 6*△◇☆光甘草定中劑量組 1 0 4 8.8 3±4.5 7*△☆ 5 6.7 8±5.9 0*△☆ 6 1 7.7 8±1 6.8 0*△☆ 9 3 4.4 5±2 0.4 3*△☆光甘草定低劑量組 1 0 3 3.3 1±3.4 5*△◇ 3 4.5 6±3.4 5*△◇ 1 1 2 7.3 4±1 1.3 5*△◇ 1 2 5 1.4 5±1 1.9 8*△◇

目前，臨床對于對比劑急性腎損傷的發(fā)病機制仍未研究清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其是一種由多種機制共同作用而引發(fā)的疾病，而氧化應(yīng)激紊亂在其中扮演著重要角色［10］。研究結(jié)果顯示，對比劑進入人體后不僅可直接產(chǎn)生大量氧自由基，還能夠抑制腎臟中過氧化氫酶及超氧化物歧化酶等抗氧化蛋白的活性，從而引起局部氧化應(yīng)激紊亂，并導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)氧化性損傷［11］。此外，對比劑還可引起腎血管的劇烈收縮，造成腎臟缺氧缺血，加劇腎臟氧自由基的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致腎小管細(xì)胞出現(xiàn)大面積壞死［12］。

臨床研究也表明，應(yīng)用超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等可減輕對比劑所致腎功能的損傷，從而證明了氧自由基在 CIN 中的致病作用［13］。 Heyman SN 等［14］學(xué)者臨床研究證實，對比劑進入患者體內(nèi)時，機體脂質(zhì)過氧化酶活性顯著升高，氧自由基大量合成與釋放，而運用大劑量抗氧劑時，對比劑所致的腎臟血流動力學(xué)及功能異常得到明顯緩解，從而證明了氧自由基在對比劑急性腎損傷發(fā)病及進展中的重要作用。由此可見，進行合理有效的抗氧化治療可能是改善對比劑急性腎損傷患者腎功能的重要方法。光甘草定是一種具有較強抗氧化活性的天然藥物，可通過降低局部氧自由基含量治療動脈粥樣硬化、動脈閉塞性腦損傷及阿爾茨海默病等疾?。?5-16］。盡管臨床針對光甘草定的抗氧化研究已較為深入，但采用其治療腎損傷的研究較少，而該藥物能否具有較好的抗對比劑急性腎損傷活性亦不明確。因此，本研究通過建立對比劑腎損傷大鼠模型，對光甘草定的防治效果進行考察，并對其主要機制進行探討，期望為該天然產(chǎn)物的應(yīng)用及對比劑腎損傷的治療提供一定的依據(jù)。

本研究利用注射對比劑成功構(gòu)建了對比劑急性腎損傷模型，該方法穩(wěn)定、成熟且可靠，且大鼠造模過程中死亡率較低。本研究中，造模后模型組Scr及BUN含量均顯著增高25%以上，證實了本研究中造模方法的可靠性，而光甘草定治療后，高劑量組、中劑量組及低劑量組Scr及BUN含量均明顯低于模型組，且病理切片結(jié)果顯示腎小球內(nèi)皮細(xì)胞變性、腎小管結(jié)構(gòu)破壞及腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤程度均不及模型組，提示光甘草定可有效改善對比劑急性腎損傷大鼠的腎臟功能。

研究結(jié)果顯示，HO-1是機體血紅素代謝反應(yīng)中的主要限速酶，具有較強的抗氧化活性，可有效避免腎臟細(xì)胞免于對比劑刺激及腎血管收縮所致的氧化性損傷［17］；CAT則是催化機體內(nèi)過氧化氫的常見蛋白，能夠改善過氧化氫所引起的腎臟損傷［18］；8-OHDG是自由基及活性氧攻擊機體DNA分子的鳥嘌呤堿基而生成的氧化性化合物，是目前腎臟細(xì)胞DNA氧化性損傷的重要標(biāo)志物之一［19］；MPO能夠催化腎臟產(chǎn)生硝基酪氨酸、3-氯化酪氨酸及酪氨?；妊趸瘎鹉I臟局部抗氧化防御機制紊亂，造成氧化應(yīng)激損傷［20］。本研究熒光免疫組化染色結(jié)果顯示，高劑量組、中劑量組及低劑量組大鼠腎組織中HO-1及CAT陽性表達情況明顯強于模型組，且相對表達量均明顯高于模型組，而8-OHDG及MPO陽性表達情況明顯弱于模型組，且相對表達量均明顯低于模型組，提示光甘草定能夠有效改善對比劑所引起的局部氧化性損傷，而該化合物的抗氧化作用可能是光甘草定有效改善對比劑急性腎損傷大鼠腎臟功能的主要機制之一。

綜上所述，光甘草定可有效地保護對比劑急性腎損傷大鼠腎臟功能，主要機制可能與其抗氧化作用有關(guān)，值得展開深入研究。然而本研究對于藥物的具體作用機制研究尚屬起步階段，后期還需對該問題進行深入闡述。此外，由于目前臨床對于對比劑急性腎損傷并無特效藥物，故陽性藥的選擇無權(quán)威性，且臨床常用的糖皮質(zhì)激素類藥物作用機制可能與本研究所探討的機制存在較大的差別，故本研究并未設(shè)置陽性藥對照組，可能對本研究的價值產(chǎn)生一定的影響。