附子與甘草不同配伍對生物堿溶出及抗炎作用的影響*

周竹晨 裴俊弛 武宇佳 林敏秋 陳偉燕 韓 進 張宇燕

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的子根加工品，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，辛、甘，大有毒；歸心、腎、脾經(jīng)，其性剛烈迅捷，走而不守，具有回陽救逆，補火助陽，散寒止痛的功效，用于亡陽虛脫及陽虛諸癥［1］?，F(xiàn)代研究表明，附子的生物活性成分是生物堿類物質(zhì)，此外還有脂類物質(zhì)以及多糖等［2-4］，具有較強的抗炎、抗腫瘤、抗衰老、強心等作用［5-8］，同時生物堿不僅是有效成分，也是附子的有毒成分［9］，具有明顯的心臟毒性和神經(jīng)毒性［10］。 甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflateBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的根及根莖，甘，平；歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥的功效［1］。甘草的化學(xué)成分主要含有三萜類、黃酮類和甘草多糖類［11］，現(xiàn)代研究表明，甘草具有較強的免疫能力、抗腫瘤、抗炎和抗變態(tài)、提高機體、抗氧化能力等［12］。在中醫(yī)臨床甘草作為常見的降低毒性和調(diào)和藥性之藥，在與有毒中藥配伍的過程中主要起“減毒”的作用［13］。傳統(tǒng)中藥配伍理論的研究和歷代醫(yī)家的臨床經(jīng)驗提示，附子配伍甘草，一則溫陽，調(diào)中補虛，加強附子回陽救逆作用；二則補偏救逆，有緩和之意，即現(xiàn)代研究所認為的減毒增效。

本實驗主要通過附子甘草不同比例的配伍，檢測其生物堿的溶出率［14］，研究附子甘草不同比例配伍對生物堿溶出的影響，從化學(xué)角度探討中醫(yī)附子甘草“減毒增效”的機制；同時通過醋酸致小鼠腹腔內(nèi)毛細血管通透性增高，觀察附子與不同比例甘草配伍后對分泌物的滲出，小鼠腹腔毛細血管通透性增高等的抑制作用，探討附子與甘草不同比例配伍后對抗炎效應(yīng)的影響。從化學(xué)角度和藥效上探討附子甘草配伍的意義，為臨床用藥配伍提供依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材 料

1.1 試藥與儀器 TU-1900雙束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。AG135電子天平：瑞士，梅特勒-托利多儀器有限公司。302型pH計：瑞士，梅特勒-托利多儀器有限公司。FZ102微型植物試樣粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司。Universal 32高速離心機：德國Hettich公司。680型酶標儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。烏頭堿對照品 （110720-200410）：中國藥品生物制品鑒定所。附子，購自浙江臨安市醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)鑒定為毛茛科植物烏頭堿Aconitum carmichaeliDebx.的子根的加工品，批號：20170210。甘草，購自浙江臨安市醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的根及根莖，批號：20170125。阿司匹林腸溶片，江蘇恩華藥業(yè)集團有限公司，國藥準字H32025931，批號：20160102。0.9%氯化鈉注射液（500 mL∶4.5 g），山東齊都藥業(yè)有限公司，國藥準字H37020764。其余均為分析純。

1.2 實驗動物 ICR小鼠，清潔級，雄性，50只，體質(zhì)量（20±2）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心供應(yīng)，在室溫為28℃的條件下飼養(yǎng)。實驗室符合國家動物實驗設(shè)施屏障系統(tǒng)標準，合格證：SYXK（浙）2013-0184。

2 方法與結(jié)果

2.1 試液的配制 1）高氯酸鐵試液的配制：70%高氯酸10 mL，緩緩加入鐵粉0.8 g，微熱使溶解，冷卻，加無水乙醇稀釋至100 mL即得。用時，取上液20 mL，加70%高氯酸6 mL，用無水乙醇稀釋至500 mL。2）堿性鹽酸羥胺試液的配制：氫氧化鈉2.5 g，加無水乙醇成20 mL；取2.5 g鹽酸羥胺，加甲醇20 mL，加熱回流使溶解。用時，兩液等量混合過濾即得。

2.2 烏頭堿對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的烏頭堿標準品10.0 mg，加無水乙醇溶解，并定容至10 mL，取1 mL溶液用乙醇稀釋并定容至10 mL，作為質(zhì)量濃度為100 μg/mL的烏頭堿對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取附子甘草不同比例配伍（見表1）提取樣品液25 mL，用氨水調(diào)節(jié)pH至9～10，用氯仿萃取 6 次（40 mL×2，30 mL×2，20 mL×2），合并萃取液，回收氯仿至干，用乙醇溶解，并定容至50 mL，作為供試品溶液。

2.4 最大吸收波長的測定 精密吸取烏頭堿對照品溶液和供試品溶液各1 mL，置25 mL量瓶中，加無水乙醇使成2.5 mL，精密加入堿性鹽酸羥胺試液1.5 mL，搖勻，在60～65℃水浴中保溫10 min，放冷，加高氯酸鐵試液13 mL，搖勻，放置5 min精密加入高氯酸試液8 mL，用高氯酸鐵試液稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白溶劑，于190～700 nm波長處掃描，測得最大吸收波長，結(jié)果在515 nm處有最大吸收。

2.5 標準曲線的繪制 分別精密吸取烏頭堿對照品溶液，按“2.4”項下方法，制備成 0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8 μg/mL不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，并以相應(yīng)試劑為空白對照，在515nm測定其吸收度。以烏頭堿對照品液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標，相應(yīng)的吸收度（Abs）為縱坐標，進行線性回歸后得到回歸方程y＝0.1401x＋0.0206（R2＝0.9989，線性范圍 0.8～4.8 μg/mL）。

2.6 精密度試驗 取烏頭堿對照品溶液，按“2.4”項下方法，并以相應(yīng)試劑為空白對照，在最大吸收波長處測定其吸收度，重復(fù)測定6次，計算其精密度計算其RSD為0.85%，說明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 分別取烏頭堿對照品溶液、供試液，按“2.4”項下方法，分別于制備后 0、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h測定其吸收度，以吸收度計算RSD分別為0.86%，0.28%。

2.8 重復(fù)性試驗 按照供試品溶液制備方法，分別制備5份附子與甘草（1∶1）提取制備的供試品溶液，各取供試品溶液1.2 mL，按“2.4”項下方法，測定吸光度，計算烏頭堿類生物堿的含量的RSD為1.00%。

2.9 回收率試驗 精密吸取附子供試品溶液，加入3個不同質(zhì)量濃度（樣品液含量的80%、100%、120%）的對照品溶液，每個濃度重復(fù)3次，按“2.4”項下方法測定吸光度，計算其回收率，結(jié)果平均回收率為97.03%，其RSD為1.03%。

2.10 附子與不同比例甘草配伍后對生物堿溶出率的影響 附子6 g，分別與甘草不同比例配伍 （見表1），分別加水 500 mL，浸漬 30 min，煎煮 1 h，過濾，藥渣加水300 mL，煎煮0.5 h，過濾，合并濾液，定容至250 mL。取定容液25 mL，用氨水調(diào)pH 9～10，氯仿萃取 6 次（40 mL×2，30 mL×2，20 mL×2），合并萃取液，回收氯仿，用甲醇溶解，并定容至10 mL。在515 nm處分別測定吸光度，根據(jù)烏頭堿的線性回歸方程計算生物堿含量。結(jié)果見表1，圖1，附子與不同比例甘草配伍后對生物堿含量均有一定的影響，當與甘草1∶3配伍時生物堿溶出率較高，表明附子與甘草按一定的比例配伍可以明顯影響生物堿含量，從而影響附子生物堿整體療效的發(fā)揮。

表1 附子與不同比例甘草配伍后對生物堿溶出率的影響（n=3）

圖1 附子與不同比例甘草配伍后對生物堿溶出的影響

2.11 附子與不同比例甘草配伍對抗炎效應(yīng)的影響將小鼠隨機分成11組，每組各6只，即：正常組；模型組；9個附子甘草配伍組 （分別給予各供試品溶液0.1 mL/10 g）；阿司匹林組（0.2 mg/10 g）。 各組灌服上述各藥，對照組、模型組灌服等量的生理鹽水。給藥1 h后，尾靜脈注射伊文思藍（2%）0.1 mL/20 g，并同時腹腔注射0.6%乙酸0.2 mL/20 g，20 min后斷頭處死，剪開腹腔，用蒸餾水沖洗數(shù)次，收集沖洗液，調(diào)整體積至10 mL，3000 r/min，離心 10 min，取上清液。 以正常組調(diào)0，在590 nm測定吸收度OD值。各組數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。

結(jié)果見表2、圖2。模型組吸收度OD值明顯升高，表明小鼠腹腔毛細血管通透性明顯增加 （與正常組比較P<0.01）；與模型組比較，附子與甘草不同比例配伍后的供試品溶液具有明顯的不同程度降低吸收度OD值（P<0.01），表明附子與甘草配伍能明顯抑制小鼠腹腔毛細血管通透性增高，且不同比例配伍呈現(xiàn)不同程度抗炎效應(yīng)。

3 分析與討論

附子中主要含有烏頭堿等生物堿類物質(zhì)，是附子的主要藥理活性成分，本實驗采用紫外可見分光光度法建立附子中生物堿含量的方法，烏頭堿屬二萜生物堿，經(jīng)紫外掃描，測得最大吸收波長為515 nm，繪制標準曲線，得回歸方程y＝0.1401x＋0.0206（R2＝0.9989，線性范圍 0.8～4.8 μg/mL），精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性都符合要求，平均回收率為97.03%。所建立的測定方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可用于生附子以及附子加工產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

表2 附子與甘草不同配伍對小鼠腹腔毛細血管通透性影響（n=6，±s）

表2 附子與甘草不同配伍對小鼠腹腔毛細血管通透性影響（n=6，±s）

與模型組比較，**P＜0.01；與正常組比較，△△P＜0.01

組別 O D值正常組 0.0 0 2 2±0.0 0 0 2模型組 0.2 3 7 1±0.0 1 0 3△△配伍組1 0.2 1 0 5±0.0 1 3 7**配伍組2 0.1 7 2 6±0.0 1 7 8**配伍組3 0.1 3 2 3±0.0 1 6 5**配伍組4 0.2 0 3 7±0.0 1 2 9**配伍組5 0.2 0 1 8±0.0 1 5 6**配伍組6 0.1 9 2 8±0.0 1 6 7**配伍組7 0.2 0 0 5±0.0 1 8 2**配伍組8 0.1 8 2 7±0.0 1 3 7**配伍組9 0.2 0 8 6±0.0 1 4 7**阿司匹林組 0.0 9 1 1±0.0 1 0 4**

圖2 附子與甘草不同配伍對小鼠腹腔毛細血管通透性影響

臨床附子與甘草不同比例配伍組成不同的方劑，體現(xiàn)不同的臨床療效。本實驗研究結(jié)果表明，附子與甘草按一定的比例配伍可以明顯影響生物堿含量，適當?shù)谋壤湮橛欣诟阶拥闹饕幱贸煞稚飰A的溶出，當附子與甘草1∶3配伍時生物堿溶出率較高，表明中藥配伍通過化學(xué)成分及含量的影響體現(xiàn)不同的臨床整體療效。同時本實驗通過醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性作用實驗研究，結(jié)果表明附子與甘草配伍能明顯抑制小鼠腹腔毛細血管通透性增高，且不同比例配伍呈現(xiàn)不同程度抗炎效應(yīng)。

當前，對于附子甘草配伍在口服用藥“減毒增效”機制的研究［15-20］，已有一定成效，有研究者推測，附子甘草配伍后，雙酯型生物堿在煎煮過程中與甘草中的某些成分成鹽或形成溶于水的絡(luò)合物，口服后，該絡(luò)合物在腸道內(nèi)將游離雙酯型生物堿釋放，以此達到減毒目的。而且，對于附子甘草配伍煎煮“減毒增效”機制的研究也有一定成效，但其具體的物質(zhì)基礎(chǔ)和機制仍不完全清楚，甚至有相左的研究結(jié)果出現(xiàn)［21］。本實驗從化學(xué)角度和抗炎藥效學(xué)角度，探討了附子與甘草不同比例配伍對化學(xué)成分和藥效的影響，充分體現(xiàn)了中醫(yī)用藥的特色及復(fù)方配伍的合理性和科學(xué)性，對配伍后附子生物堿含量變化和藥效的分析，能初步闡述配伍發(fā)揮減毒增效的物質(zhì)基礎(chǔ)，合理地探討中醫(yī)配伍發(fā)揮減毒增效的化學(xué)機制，進一步為附子甘草配伍減毒增效的作用機理研究提供了科學(xué)依據(jù)，為中藥復(fù)方配伍研究提供新的思路與方法，也為臨床合理配伍提供參考。