長非編碼RNA TNRC6CAS1作為ceRNA在肥厚型心肌病發(fā)生發(fā)展中調(diào)控BPTF表達(dá)的研究

匡 野， 董玉琳， 吉 永， 曹向紅

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科， 昆明 650051)

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一種以心肌細(xì)胞肥厚為特征的原發(fā)性心肌病，主要表現(xiàn)在心室壁肥厚不對稱，心室內(nèi)腔變小，射血分?jǐn)?shù)出現(xiàn)增加或不變，左室流出道梗阻，舒張功能異常和心肌缺血等[1-3]。作為心血管疾病中典型的遺傳性疾病，肥厚型心肌病的病因尚不明確，有明確的遺傳性特征，為染色體顯性遺傳[4]。肥厚型心肌病的細(xì)胞分子機制涉及到多種基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)節(jié)，即伴隨著肥厚型心肌病的發(fā)生發(fā)展，特異致病基因選擇性地上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。目前，越來越多的研究集中在關(guān)于肥厚型心肌病基因及微RNA(microRNA, miRNA)，長非編碼RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)差異表達(dá)方面[5-7]。發(fā)現(xiàn)并用于臨床早期篩查診斷和治療的新興分子標(biāo)志物，闡明各個差異表達(dá)的分子之間網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系，是現(xiàn)在研究肥厚型心肌病疾病的重點。

競爭性內(nèi)源 RNA(competing endogenouse RNA，ceRNA)是一種能夠競爭結(jié)合RNA的作用元件。miRNA可以通過結(jié)合mRNA導(dǎo)致基因沉默，而ceRNA可以通過競爭性地結(jié)合miRNA來調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。近年，關(guān)于ceRNA在心血管疾病的病理機制及診治方面的作用研究有較多報道[8-10]。ceRNA所揭示的lncRNA、mRNA和miRNA之間的調(diào)控可能與心肌肥厚疾病有著密切的關(guān)系。染色質(zhì)重塑因子(bromodomain PHD finger transcription factor，BPTF)是核小體重塑復(fù)合體最重要的一個亞基。BPTF 在DNA表觀遺傳學(xué)上的調(diào)節(jié)尤為明顯，可以引起多種基因和信號通路的異常[11-14]。在本研究中，通過生物信息學(xué)分析Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)BPTF和lncRNA TNRC6CAS1在肥厚型心肌病患者心肌組織中異常表達(dá)上調(diào)，miR-30c-1-3p異常表達(dá)下調(diào)，并在臨床樣本和心肌肥大細(xì)胞模型中進(jìn)一步驗證三者的表達(dá)異常。并以BPTF為核心mRNA，建立了lncRNA TNRC6CAS1- miR-30c-1-3p-BPTF的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并初步驗證三者的表達(dá)調(diào)控關(guān)聯(lián)。最后，初步驗證了lncRNA TNRC6CAS1，miR-30c-1-3p和BPTF對心肌肥大細(xì)胞模型的影響。研究的結(jié)果豐富了肥厚型心肌病分子調(diào)控模式。同時，lncRNA TNRC6CAS1，miR-30c-1-3p和BPTF作為潛在的肥厚型心肌病致病分子，有望成為新的檢測和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)庫選擇

本研究從 GEO數(shù)據(jù)庫中下載研究號為GSE130036和GSE36946的RNA測序數(shù)據(jù)集。其中，GSE130036數(shù)據(jù)集包含28位肥厚型心肌病患者和9位健康志愿者心肌組織的mRNA和lncRNA數(shù)據(jù)表達(dá)譜，GSE36946 包含107位肥厚型心肌病患者和20位健康志愿者心肌組織的miRNA數(shù)據(jù)表達(dá)譜。

1.2 肥厚型心肌病患者的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)超聲心動圖檢測左心室心肌某節(jié)段或多個節(jié)段室壁厚度≥15 mm。(2)超聲心動圖檢測室壁增厚程度為 13～14 mm，合并家族病史，心肌室壁厚度包括左心室壁厚度或其他節(jié)段心室肌厚度≥13 mm，無法用其他疾病或病因解釋；(3)排除主動脈狹窄和先天性心血管疾病、代謝性疾病以及運動員的心肌肥厚、代謝性疾病等引起的繼發(fā)性心肌肥厚。本項目所用臨床樣本為血液廢棄物(健康體檢者和患者血常規(guī)剩余全血)。整個實驗過程和方案已經(jīng)取得昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院倫理委員會的審查批準(zhǔn)。

1.3 試劑及相關(guān)試劑盒

細(xì)胞培養(yǎng)基1640(cat. no. 31870082; Thermo Fisher Scientific, Inc.)；胎牛血清 (cat.no.10099141; Thermo Fisher Scientific, Inc.)；青霉素-鏈霉素溶液(cat.no.C0222; 碧云天生物有限公司)；血管緊張素II(cat.no.A9290;北京索萊寶科技有限公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine(cat.no.18324020; Thermo Fisher Scientific, Inc.)；RNA提取試劑盒(cat.no.12183018A；Thermo Fisher Scientific, Inc.)；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(cat.no.AE301-02；北京全式金生物技術(shù)公司)和TransStart Tip Greenq PCR SuperMix試劑盒(cat.no.AQ142-11；北京全式金生物技術(shù)公司)；心鈉肽(natriuretic peptide A，ANP), 腦鈉肽(natriuretic peptide B，BNP)和 β-肌球蛋白重鏈(β-Myosin Heavy Chain，β-MHC)ELISA試劑盒(cat.no.EIAANP, EHNPPB; Thermo Fisher Scientific, Inc；cat.no.kt98804, 武漢默沙克生物科技有限公司)；一抗BPTF，β-MCH，β-肌動蛋白(β-actin)(cat.no.ab288159，ab170867，ab8226；Abcam Inc.), 心鈉肽，腦鈉肽(cat.no.702539，PA5-96084；Thermo Fisher Scientific, Inc)；miR-30c-1-3p mimics (cat.no.4464066; Thermo Fisher Scientific, Inc.)；ECL發(fā)光試劑盒(cat.no.P0018S；碧云天生物技術(shù)公司)；TNRC6C-AS1 siRNA (cat.no.1299001; Thermo Fisher Scientific, Inc.)；BPTF siRNA(cat.no.4392420；Thermo Fisher Scientific, Inc)。引物合成見Table 1(上海生工生物工程有限公司)。

Table 1 Quantitative RT-PCR primer sequences

1.4 主要儀器

實時定量PCR儀(AppliedBiosystems,Inc)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；微量紫外分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Inc.)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)等。

1.5 AC16細(xì)胞培養(yǎng)和處理

以正常人心肌體外細(xì)胞系 AC16 細(xì)胞作為模型。AC16細(xì)胞在1640培養(yǎng)基下培養(yǎng)，培養(yǎng)基包含10%胎牛血清和雙抗(終濃度10 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)。AC16細(xì)胞在37 ℃，5% CO2的無菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以Lipofectamine作為轉(zhuǎn)染試劑，對AC16細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30c-1-3p mimics ，提高AC16細(xì)胞miR-30c-1-3p的表達(dá)水平。對AC16細(xì)胞轉(zhuǎn)染TNRC6C-AS1 siRNA或BPTF siRNA，用于沉默AC16細(xì)胞的TNRC6C-AS1或BPTF表達(dá)水平。利用150 nom/L血管緊張素II處理AC16細(xì)胞24 h，進(jìn)行心肌肥大細(xì)胞模型造模。檢測心肌肥大標(biāo)志物心鈉肽, 腦鈉肽和 β-肌球蛋白重鏈的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，對病理模型進(jìn)行驗證。

1.6 生物信息學(xué)方法對核心mRNA，lncRNA和miRNA的篩選

首先下載數(shù)據(jù)庫GEO數(shù)據(jù)庫研究號為GSE130036和GSE36946的RNA測序數(shù)據(jù)集。利用R語言中的limma包進(jìn)行差異分析(P<0.01，F(xiàn)DR<0.05, log2fold-change>2.0 或 log2fold-change<0.5)，篩選出差異表達(dá)的mRNA，lncRNA和miRNA，同時利用ggplot和pheatmap包進(jìn)行可視化。利用R語言中的clusterprofiler包對差異mNRA進(jìn)行生物功能富集分析，即基因本體(Gene Ontology，GO)及京都基因和基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析。根據(jù)富集的條目數(shù)及P值，進(jìn)一步篩選核心mRNA。

1.7 ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)對能夠靶向結(jié)合BPTF的miRNA進(jìn)行預(yù)測，通過LncBase v2(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=lncbasev2/index-predicted)對能夠靶向差異表達(dá)lncRNA的miRNA進(jìn)行預(yù)測。將上述二者得到miRNA分別與差異表達(dá)的miRNA取交集，獲得miRNA-mRNA和miRNA-lncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。將miRNA-mRNA和miRNA-lncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整合，并通過Cytoscape_v3.7.1進(jìn)行可視化，從而形成lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.8 RNA提取及實時定量PCR

利用總RNA提取試劑盒對肥厚型心肌病患者外周血，健康體檢者外周血，處理后的AC16細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，并測定RNA濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：25 ℃反應(yīng)10 min(miRNA省略)，42 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL PCR產(chǎn)物用DEPC水稀釋至100 μL，作為qPCR的模板。qPCR反應(yīng)條件為 95 ℃，10 min，1 循環(huán)(cycle)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，兩者共40循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，導(dǎo)出各孔Ct值。GAPDH和U6作為內(nèi)參基因。采用 2-ΔΔct法進(jìn)行組之間mRNA，miRNA和lncRNA的表達(dá)差異分析。

1.9 免疫印跡分析

利用蛋白裂解液進(jìn)行各組分蛋白質(zhì)提取。利用BCA法對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定。取等量5 μg蛋白質(zhì)，利用SDS-PAGE，對不同分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并在室溫下，用封閉緩沖液封閉2 h。將PVDF膜與一抗孵育4 ℃過夜。一抗稀釋濃度如下：心鈉肽(1∶2 500)，腦鈉肽(1∶1 000)，β-MHC(1∶2 000)，β-肌動蛋白(1∶1 000)和染色質(zhì)重塑因子(1∶1 000)。用Tris緩沖液和吐溫20(TBST)洗滌膜3次，每次10 min。在室溫下，與二抗孵育2 h。再次用Tris緩沖液和吐溫20(TBST)洗滌膜3次，每次10 min。在黑暗中用ECL溶液孵育膜10 min，隨后，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附檢測

將50 μL標(biāo)準(zhǔn)品，非特異性結(jié)合陰性對照和待測樣本加入至酶標(biāo)板內(nèi)。向每孔加入75 μL 1×測定緩沖液和25 μL ANP，BNP或β-MHC結(jié)合物。向除陰性對照孔外的每個孔中，加入25 μL ANP，BNP或β-MHC抗體。輕微震動平板混勻液體，用密封紙覆蓋平板，在室溫下孵育1 h。將每孔液體去除，并用300 μL 1×洗滌緩沖液洗滌每孔4次，每次5 min。向每個孔中添加100 μL TMB反應(yīng)液。在室溫下孵育30 min，同時在搖床上進(jìn)行輕微搖動。添加50 μL反應(yīng)終止液，室溫反應(yīng)10 min，溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下進(jìn)行吸光值的檢測。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

Statistical Product and Service Solutions(SPSS)軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗至少重復(fù)3次以上，并以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表現(xiàn)。t檢驗用于非配對兩組之間的統(tǒng)計學(xué)差異。其中，P<0.05定義為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通過對GEO數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，染色質(zhì)重塑因子表達(dá)在肥厚型心肌病患者中明顯上調(diào)

根據(jù)方法中限定閾值，篩選出表達(dá)差異明顯的mRNA，miRNA和lncRNA。一共得到1 462個顯著差異表達(dá)的mRNA。其中，在肥厚型心肌病組織中，上調(diào)的mRNA有428個，下調(diào)的mRNA有1 034；84個顯著差異表達(dá)的 miRNA，其中在肥厚型心肌病組織中，上調(diào)的miRNA有46個，下調(diào)miRNA有38個；得到34個顯著差異表達(dá)的lncRNA，其中在肥厚型心肌病組織中，上調(diào)的lncRNA有8個，下調(diào)的 lncRNA有26個；由于基因較多，本文選取了上調(diào)和下調(diào)最明顯的30個mRNA進(jìn)行熱圖繪制。差異mRNA，lncRNA和miRNA的熱圖、火山圖見Fig.1A，B。其中，BPTF的表達(dá)在肥厚型心肌病組織中，明顯上調(diào)(log2fold change=5.13)，P值0.0000412。GEO數(shù)據(jù)中GSE130036子集的肥厚型心肌病患者臨床信息匯總結(jié)果正如Table 2所示。

Fig.1 BPTF expression was significantly upregulated in patients with hypertrophic cardiomyopathy through the analysis of GEO database (A) Heatmap of differentially expressed mRNA, miRNA and lncRNA between HCM and normal tissues from GSE130036 or GSE36946 databases. Red represents up-regulated genes and blue represents down-regulated genes in HCM tissues. (B) Volcano plot. Gray represents non-differentially expressed genes, red represents up-regulated genes, and green represents down-regulated genes in HCM tissues. HCM: hypertrophic cardiomyopathy; NoDiff: no different; BPTF: bromodomain PHD finger transcription factor

Table 2 Summary of clinical information of HCM patients in GEO database (GSE130036)

2.2 基因本體(GO)及京都基因和基因組百科全書(KEGG)分析發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)重塑因子被多個條目富集

采用基因本體(GO)分析，將所有肥厚型心肌病相關(guān)差異mRNA歸類到生物學(xué)過程(biological processes，BP)，細(xì)胞組件(cell components，CC)，分子功能(molecular function，MF)3種生物學(xué)關(guān)系中，取P值有顯著意義的進(jìn)行作圖(見Fig.2A-C)。對差異基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析結(jié)果正如Fig.2D。BPTF在所有差異基因中，被富集的相關(guān)條目最多，具體富集條目見Fig.2E。由于BPTF在肥厚型心肌病組織中明顯上調(diào)，本文選擇BPTF作為研究對象。

Fig.2 BPTF was enriched by multiple items through GO analysis and KEGG analysis (A-D) GO and KEGG analysis of differentially expressed mRNAs in HCM, including biological processes, cell components and molecular function. Dot size indicates the number of enriched genes; dot color represents the size of the P value. (E) BPTF enriched terms by GO analysis. BPTF: bromodomain PHD finger transcription factor; HCM: hypertrophic cardiomyopathy; GO: Gene Ontology; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; BP: biological processes; CC: cell components; MF: molecular function

2.3 lncRNA TNRC6CAS1-miR-30c-1-3p-BPTF ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

圍繞BPTF形成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)結(jié)果如Fig.3A所示。其中，lncRNA TNRC6C-AS1與BPTF關(guān)聯(lián)的miRNA最多。本文選擇lncRNA TNRC6C-AS1作為研究對象。根據(jù)ceRNA的理論，lncRNA通過競爭結(jié)合miRNA，減少miRNA對靶基因的抑制，表達(dá)趨勢的特點顯示，miRNA的表達(dá)趨勢與lncRNA和mRNA相反，從結(jié)合位點顯示，研究的miRNA應(yīng)該與BPTF和 TNRC6C-AS1具備特異性結(jié)合。所以，本文進(jìn)一步篩選關(guān)聯(lián)miRNA。最后得到miR-30c-1-3p和miR-182-5p(Fig.3B)。本文選擇miR-30c-1-3p作為研究對象，模擬了miR-30c-1-3p與BPTF和TNRC6C-AS1啟動子的結(jié)合位點(Fig.3C)。

Fig.3 Construction of lncRNA TNRC6C-AS1-miR-30c-1-3p-BPTF ceRNA network (A) Construction of the ceRNA network around BPTF. Blue represents miRNA, orange represents mRNA and pink represents lncRNA. (B) Screening process of miR-30c-1-3p. (C) Binding sites of miR-30c-1-3p to BPTF and TNRC6C-AS1 promoters. BPTF: bromodomain PHD finger transcription factor

2.4 染色質(zhì)重塑因子和長非編碼RNA TNRC6CAS1在肥厚型心肌病患者中表達(dá)異常上調(diào)，而miR-30c-1-3p異常下調(diào)

正如Fig.4A所示，BPTF，miR-30c-1-3p和TNRC6C-AS1分別在GEO數(shù)據(jù)庫中GSE130036或GSE36946 RNA測序數(shù)據(jù)集中的表達(dá)程度。從GEO測序數(shù)據(jù)中可以得出相較于正常組織，BPTF和TNRC6C-AS1在肥厚型心肌病患者組織中明顯上調(diào)(P<0.001)，miR-30c-1-3p在肥厚型心肌病患者的組織中明顯下調(diào)(P<0.001)。本文利用RT-qPCR實驗，利用收集的肥厚型心肌病患者和健康體檢者外周血，進(jìn)一步比較BPTF，miR-30c-1-3p和TNRC6C-AS1表達(dá)差異性。結(jié)果如Fig.4B所示，BPTF和TNRC6C-AS1的mRNA水平在肥厚型心肌病患者外周血中升高，分別是健康體檢組的6.31±2.24倍(P<0.001)和3.51±1.62倍(P<0.001) 。miR-30c-1-3p在肥厚型心肌病患者外周血中表達(dá)下降是健康體檢組的38.51%±16.20%(P<0.001)。HMC患者的臨床信息匯總結(jié)果見Table 3。

Fig.4 Abnormal expression of BPTF, lncRNA TNRC6C-AS1 and miR-30c-1-3p in patients with hypertrophic cardiomyopathy (A) The expression of BPTF, miR-30c-1-3p and TNRC6C-AS1 in GSE130036 or GSE36946 RNA sequencing data sets, respectively. Each point represents an independent sample. Normal groups vs. HCM groups, ***P<0.001. (B) Expression of BPTF, miR-30c-1-3p and TNRC6C-AS1 in the peripheral blood of healthy subjects and patients with HCM using RT-qPCR assays. Normal groups vs. HCM groups, ***P<0.001. BPTF: bromodomain PHD finger transcription factor; HCM: hypertrophic cardiomyopathy

Table 3 Summary of clinical sample information of HCM patients

2.5 染色質(zhì)重塑因子和長非編碼RNA TNRC6CAS1在心肌肥大細(xì)胞模型中表達(dá)異常上調(diào)，而miR-30c-1-3p異常下調(diào)

血管緊張素II是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型的經(jīng)典方法。本文用150 nmol/L血管緊張素II作用于AC16細(xì)胞24 h。結(jié)果正如Fig.5A所示，AC16細(xì)胞經(jīng)過150 nmol/L血管緊張素II處理24 h，細(xì)胞蛋白質(zhì)/DNA比值出現(xiàn)明顯升高，是對照組的4.03±1.50倍(P<0.001)。結(jié)果正如Fig5B所示，RT-qPCR結(jié)果表明，心肌肥大標(biāo)志物心鈉肽、腦鈉肽和β-肌球蛋白重鏈的mRNA水平明顯升高，分別是對照組的4.80±1.68倍(P<0.05)，2.68±0.13倍(P<0.001)和4.63±0.45倍(P<0.001)。結(jié)果正如Fig.5C，D所示，ELISA結(jié)果表明，心鈉肽、腦鈉肽和 β-肌球蛋白重鏈的蛋白質(zhì)水平出現(xiàn)明顯升高，分別是對照組的3.88±0.60倍(P<0.01)，3.09±0.95倍(P<0.001)和3.49±0.31倍(P<0.001)，Western 印跡結(jié)果趨勢與ELISA結(jié)果一致。綜上所述，利用血管緊張素II對AC16細(xì)胞進(jìn)行心肌肥大誘導(dǎo)成功。

Fig.5 Abnormal expression of BPTF, lncRNA TNRC6C-AS1 and miR-30c-1-3p in the model of myocardial hypertrophy Myocardial hypertrophy model induced by Ang II in AC16 cells. (A) The cellular protein/DNA ratio in AC16 cells treated or non-treated with 150 nmol/L Ang II for 24 hours. Ang II groups vs Control groups, *P<0.05. (B) The mRNA expression of ANP, BNP and β-MHC was detected in AC16 cells treated or non-treated with 150 nmol/L Ang II for 24 hours using RT-qPCR assays. Ang II groups vs. Control groups, *P<0.05, ***P<0.001. (C-D) The protein expression of ANP, BNP and β-MHC was detected in AC16 cells treated or non-treated with 150 nmol/L Ang II for 24 hours using Western blotting or ELISA. Ang II groups vs. Control groups, **P<0.01, ***P<0.001. (E) RT-qPCR. RNA levels of BPTF, miR-30c-1-3p and TNRC6C-AS1. Ang II groups vs. Control groups, ***P<0.001. (F) RT-qPCR or Western blotting. The mRNA or protein expression of BPTF. Ang II groups vs. Control groups, ***P<0.001. BPTF: bromodomain PHD finger transcription factor; Ang II: Angiotensin II; ANP: natriuretic peptide A; BNP: natriuretic peptide B; β-MHC: β-Myosin Heavy Chain. ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay

本文進(jìn)一步在建立的心肌肥大細(xì)胞模型中檢測BPTF，miR-30c-1-3p和TNRC6C-AS1的表達(dá)變化。結(jié)果正如Fig.5E，F(xiàn)所示，RT-qPCR結(jié)果表明，BPTF和TNRC6C-AS1的表達(dá)水平在心肌肥大細(xì)胞模型中出現(xiàn)上調(diào)，分別是對照組的7.45±0.68倍(P<0.001)和6.15±1.14倍(P<0.001)，miR-30c-1-3p的表達(dá)在心肌肥大細(xì)胞模型組中出現(xiàn)下調(diào)是對照組的27.02%±2.88%(P<0.001)。Western 印跡結(jié)果表明，BPTF蛋白表達(dá)在心肌肥大細(xì)胞模型中同樣出現(xiàn)上調(diào)。綜上所述，本文在心肌肥大細(xì)胞模型中再次驗證了BPTF和TNRC6C-AS1表達(dá)的上調(diào)，miR-30c-1-3p表達(dá)的下調(diào)。

2.6 染色質(zhì)重塑因子的表達(dá)與長非編碼RNA TNRC6CAS1構(gòu)成正向關(guān)系，與miR-30c-1-3p構(gòu)成負(fù)向關(guān)系

本文對AC16細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30c-1-3p mimics，轉(zhuǎn)染后miR-30c-1-3p的表達(dá)提高是對照組的6.05±0.79倍(P<0.001, Fig.6A)。對AC細(xì)胞轉(zhuǎn)染TNRC6C-AS1 siRNA，轉(zhuǎn)染后TNRC6C-AS1的表達(dá)下降是對照組的13.59%±4.51%(P<0.001, Fig.6B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AC16細(xì)胞過表達(dá)miR-30c-1-3p或沉默TNRC6C-AS1后，BPTF的mRNA表達(dá)都會出現(xiàn)下調(diào)，分別是對照組的41.12%±3.20%(P<0.001)和66.67%±5.41%(P<0.001)，蛋白質(zhì)表達(dá)同樣出現(xiàn)下降(Fig.6C，D)。這些結(jié)果表明，TNRC6C-AS1的表達(dá)與BPTF的表達(dá)構(gòu)成正向關(guān)系。miR-30c-1-3p的表達(dá)和BPTF的表達(dá)構(gòu)成負(fù)向關(guān)系。

Fig.6 The expression of BPTF has a positive relationship with lncRNA TNRC6C-AS1 and a negative relationship with miR-30c-1-3p The AC16 cells were transfected with miR-30c-1-3p mimics, TNRC6C-AS1 siRNA and the corresponding negative control. (A) The expression of miR-30c-1-3p was detected in AC16 cells transfected with miR-30c-1-3p mimics or the negative control using RT-qPCR. negative control groups vs. miR-30c-1-3p mimics groups, *** P<0.001. (B) The expression of TNRC6C-AS1 was detected in AC16 cells transfected with TNRC6C-AS1 siRNA or the negative control using RT-qPCR; negative control groups vs. TNRC6C-AS1 siRNA groups, *** P<0.001. (C, D) The mRNA expression of BPTF was detected in AC16 cells transfected with TNRC6C-AS1 siRNA, miR-30c-1-3p mimics or the negative control using RT-qPCR; negative control groups vs. miR-30c-1-3p mimics groups, *** P<0.001; negative control groups vs. TNRC6C-AS1 siRNA groups,*** P<0.001. NC: negative control; BPTF: bromodomain PHD finger transcription factor

2.7 沉默染色質(zhì)重塑因子，長非編碼RNATNRC6C-AS1或過表達(dá)miR-30c-1-3p可以抑制心肌肥大標(biāo)志性蛋白質(zhì)表達(dá)

利用150 nmol/L 血管緊張素II處理AC16細(xì)胞24 h后誘導(dǎo)心肌肥大，同時轉(zhuǎn)染TNRC6C-AS1siRNA，BPTF siRNA或miR-30c-1-3p mimics. 結(jié)果正如Fig.7A和B所示，AC16細(xì)胞心肌肥大模型沉默TNRC6C-AS1，BPTF或過表達(dá)miR-30c-1-3p后。Protein/DNA比值出現(xiàn)明顯下降，分別是對照組的75.86%±4.22%(P<0.001),64.34%±4.84%(P<0.001)和63.19%±10.54%(P<0.001)。心肌肥大標(biāo)志性蛋白質(zhì)心鈉肽、腦鈉肽和β-肌球蛋白重鏈出現(xiàn)明顯下降。以上結(jié)果表明，沉默BPTF，TNRC6C-AS1或過表達(dá)miR-30c-1-3p可以抑制心肌肥大標(biāo)志性蛋白質(zhì)表達(dá)。

Fig.7 Silencing BPTF, TNRC6C-AS1 or overexpressing miR-30c-1-3p could inhibit the expression of cardiac hypertrophy marker proteins (A) The protein/RNA radio was detected in Ang II-induced AC16 cells transfected with miR-30c-1-3p mimics, TNRC6C-AS1 siRNA, BPTF siRNA or the negative control. negative control groups vs. miR-30c-1-3p mimics groups, *** P<0.001; negative control groups vs.TNRC6C-AS1 siRNA groups, *** P<0.001; negative control groups vs. BPTF siRNA groups,*** P<0.001. (B) The protein expression of ANP, BNP and β-MHC was detected in Ang II-induced AC16 cells transfected with miR-30c-1-3p mimics, TNRC6C-AS1 siRNA, BPTF siRNA or the negative control. BPTF: bromodomain PHD finger transcription factor; Ang II: Angiotensin II; ANP: natriuretic peptide A; BNP: natriuretic peptide B; β-MHC: β-Myosin Heavy Chain

3 討論

肥厚型心肌病是一種原發(fā)性心肌病，以心肌細(xì)胞肥厚作為主要特征，表現(xiàn)出特有的家族遺傳性，為染色體顯性遺傳[15, 16]。絕大多數(shù)的肥厚型心肌病患者難以發(fā)覺。發(fā)病時多為突發(fā)性，表現(xiàn)為呼吸困難，胸痛、頭暈和心悸等，嚴(yán)重者會導(dǎo)致心力衰竭，甚至猝死[17]?，F(xiàn)今，發(fā)現(xiàn)與肥厚型心肌病發(fā)生發(fā)展的致病基因有20個以上，其中有多達(dá)1 400個突變位點, 相關(guān)的miRNA也有接近20個突變位點[18, 19]。但是，關(guān)于ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控在肥厚型心肌病發(fā)生發(fā)展中作用的報道很少。Yuan等[20]報道，lncRNA CYTOR通過miR-155及其下游IKKi和NF-κB信號通路，在心肌肥厚中發(fā)揮保護(hù)作用。lncRNA CYTOR在整個調(diào)控過程中作為miR-155的ceRNA，以競爭miR-155介導(dǎo)的IKBKE(Inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit epsilon)表達(dá)抑制。Guo等[21]通過生物信息學(xué)分析，構(gòu)建了包含6個CircRNA、29個miRNA和6個mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。通過功能分析發(fā)現(xiàn)，這些ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的環(huán)狀RNA與鈣釋放通道活性和肌絲滑動有關(guān)。同時，提出了hsa_circ0043762、hsa_circ0036248和hsa_circ0071269可能是參與肥厚型心肌病發(fā)病機制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。雖然肥厚型心肌病在分子研究方面取得了一定的成果，但要完全將這些分子作為診斷和治療肥厚型心肌病的新分子靶標(biāo)，仍需要進(jìn)一步明確其作用機制以及分子之間是如何網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的。

BPTF(bromodomain PHD finger transcription factor)作為染色質(zhì)重塑復(fù)合體的最大亞基，在DNA表觀遺傳學(xué)上的調(diào)節(jié)尤為明顯，可以引起多種基因和信號通路的異常。關(guān)于BPTF與疾病的關(guān)聯(lián)更多的是集中在癌癥的發(fā)生機制中。Richart等[22]報道，通過生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，BPTF可以對cMYC的轉(zhuǎn)錄有明顯的驅(qū)動作用。通過沉默BPTF可以使胰腺腺泡細(xì)胞癌的增殖受到抑制，延長病人的生存期，BPTF可以作為潛在的癌癥治療靶點。Ding等[23]報道, circ DONSON定位于細(xì)胞核，將NURF復(fù)合物SNF2L(SNF2L chromatin remodeling protein), BPTF 或RBBP4(Retinoblastoma binding protein 4)招募到SOX4(SRY-box transcription factor 4)啟動子，并啟動其轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)體內(nèi)胃癌細(xì)胞的生長。有其他研究報道，BPTF在肝癌和肺癌等癌癥治療中也有顯著的影響[24, 25]。迄今為止，BPTF在肥厚型心肌病的發(fā)展中的精確功能和分子機制仍然知之甚少。

本研究通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，BPTF在肥厚型心肌病患者心肌組織中異常高表達(dá)，并在臨床樣本中進(jìn)一步驗證其表達(dá)上調(diào)。以BPTF為核心的mRNA，以及明顯差異表達(dá)的miRNA和LcnRNA構(gòu)建了lncRNA TNRC6CAS1-miR-30c-1-3p-BPTF的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并初步驗證了三者的表達(dá)相關(guān)性。最后，初步驗證了lncRNA TNRC6CAS1，miR-30c-1-3p和BPTF對心肌肥大細(xì)胞模型的影響。文章不足之處在于，Ang II誘導(dǎo)的心肌肥大無法代表肥厚型心肌病模型，只能模擬肥厚型心肌病引起的心肌肥大病理現(xiàn)象。在后續(xù)的研究中，我們也會引入肥厚型心肌病動物模型，更加深入地對發(fā)病的調(diào)控分子機制進(jìn)行研究。

綜上所述，我們的研究得出結(jié)論，lncRNA TNRC6CAS1-miR-30c-1-3p-BPTF作為潛在的致病基因，可能參與調(diào)控了肥厚型心肌病心肌肥大病理現(xiàn)象的產(chǎn)生。同時，lncRNA TNRC6CAS1，miR-30c-1-3p和BPTF作為潛在的肥厚型心肌病致病分子，有望成為新的檢測和治療的靶點。