微小RNA—221在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

賀家勇　楊晨晨　徐茜

[摘要] 目的 探討微小RNA-221（miRNA-221）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)及意義。 方法 收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2010年1月～2011年1月接受肺葉切除+系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃的53例NSCLC患者的臨床資料。采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)上述NSCLC組織及癌旁組織標(biāo)本中miRNA-221的水平。分析miRNA-221表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系，采用Kaplan-Meier方法分析miRNA-221表達(dá)與NSCLC生存期（OS）之間的關(guān)系。 結(jié)果 miRNA-221在NSCLC組織中的相對(duì)表達(dá)量為（0.0234±0.0002），在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量為（0.0095±0.0003），miRNA-221在NSCLC組織中的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織（P < 0.05）。31例miRNA-211相對(duì)高表達(dá)。TNM分期中Ⅲ期患者miRNA-221的表達(dá)量高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P < 0.05）。Kaplan-Meir生存分析結(jié)果顯示，miRNA-221高表達(dá)患者中位OS為36.4個(gè)月，miRNA-221高表達(dá)與低表達(dá)患者OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 miRNA-221是潛在的肺癌預(yù)后預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物，miRNA-221可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 微小RNA-221；非小細(xì)胞肺癌；表達(dá)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R734 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）11（b）-0097-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of microRNA-221 in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods A total of 53 NSCLC cases′ clinical material were collected from Cancer Hospital Affiliated of Xinjiang Medical University from January 2010 to January 2011， and all the cases accepted pulmonary lobectomy and systematic mediastinal lymphadenectomy. Levels of miRNA-221 in the NSCLC and adjacent tissues were examined by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The relationship between expression level of miRNA-221 and clinic pathological parameters were analyzed. Kaplan-Meier was used to analyze the relationship between miRNA-221 expression and overall survival （OS）. Results The relative expression of miRNA-221 in NSCLC tissues was （0.0234±0.0002）， and it was （0.0095±0.0003） in adjacent tissues. The relative expression of miRNA-221 in NSCLC tissues was higher than that in adjacent tissues （P < 0.05）. There were 31 cases having relative higher expression. The level of miRNA-221 was significantly higher in TNM stage Ⅲ than that in TNM stage Ⅰ-Ⅱ（P < 0.05）. Kaplan-Meir survival analysis results manifested that the median OS of patients with miRNA-221 high expression was 36.4 months. There was no significant difference in OS between miRNA-221 low expression and high expression patients（P > 0.05）. Conclusion miRNA-221 is a potential molecular marker for the prognosis of lung cancer， which may be involved in the development and progression of NSCLC.

[Key words] Micro RNA-221； Non-small cell lung cancer； Expression

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發(fā)病占所有肺癌發(fā)病的85%，NSCLC患者的5年生存率仍不到15%[1-3]，對(duì)NSCLC預(yù)后分子標(biāo)志物的判斷有助于NSCLC的早期診斷和提高患者的總生存時(shí)間[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度為24～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA[5]，多項(xiàng)研究證明miRNA在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[6-8]。miRNA通過(guò)結(jié)合mRNA3′-UTR非翻譯區(qū)（3′-UTR）導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制而調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA-221是其中重要的miRNA，研究表明，miRNA-221是一種致癌miRNA[9-10]，miRNA與肺癌的關(guān)系文獻(xiàn)目前鮮有報(bào)道。本研究回顧性分析53例NSCLC患者的臨床資料，檢測(cè)miRNA-221在肺癌組織中的表達(dá)情況，探討miRNA-221與肺癌的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

篩選新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2010年1月～2011年1月接受標(biāo)準(zhǔn)肺癌根治術(shù)（肺葉切除+系統(tǒng)性縱隔淋巴結(jié)清掃）的NSCLC鱗癌腺癌患者106例，并進(jìn)行電話隨訪。納入標(biāo)準(zhǔn)：完成隨訪病例；Ⅱ、Ⅲ期[11]患者術(shù)后接受過(guò)系統(tǒng)性含鉑方案兩藥聯(lián)合化療4周期；Ⅰ期患者術(shù)后隨訪至腫瘤復(fù)發(fā)后才接受全身化療；有癌組織和癌旁組織病理標(biāo)本的患者。共納入53例，平均年齡（55.8±9.7）歲；男29例，女24例；Ⅰ期患者25例，Ⅱ期16例，Ⅲ期12例（UICC第2007版）；鱗癌24例，腺癌29例。

1.2 隨訪情況

53例NSCLC患者術(shù)后采用電話隨訪形式。隨訪時(shí)間自手術(shù)之日起，至2017年1月1日。終點(diǎn)事件為患者死亡。評(píng)價(jià)指標(biāo)為患者1、2、3年總生存（OS）率。

1.3 主要儀器及試劑

miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑（Thermo，立陶宛），miR cute miRNA提取分離試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，熒光定量PCR儀[羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司，型號(hào)：IQ5]，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf艾本德中國(guó)有限公司，miRNA-221引物、內(nèi)參U6引物[寶生物（大連）有限公司]，紫外分光光度儀（上海棱光技術(shù)有限公司）。

1.4 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）方法

1.4.1 蠟塊組織總RNA提取 采用miRNAeasy總RNA提取試劑盒提取NSCLC及癌旁正常石蠟組織總RNA，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，測(cè)定每個(gè)樣本在OD260/OD280 nm處的吸光度值，核酸蛋白檢測(cè)要求A260/A280在1.8～2.0之間，計(jì)算miRNA的濃度。將提取的DNA用cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，樣本置-80℃冰箱保存。

1.4.2 RT-PCR檢測(cè) PCR總反應(yīng)體系：20 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，其余加ddH2O補(bǔ)足，2×qPCR Mix 10 mL，以U6為內(nèi)參，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，然后95℃ 20 s、60℃ 20 s、72℃ 40 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，獲得Ct值。miRNA各引物序列見(jiàn)表1。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析 分析目的基因的表達(dá)水平是以U6作為內(nèi)源參照。△Ct（n）=目的基因Ct（n）均數(shù)-參照基因Ct（n）均數(shù)；△△Ct（n）=△Ct（n）-△Ct（1）；然后算出2-△△Ct。將2-△△Ct中位數(shù)作為分界值（0.0124）。將患者分為miRNA-221低表達(dá)組和高表達(dá)組，≥0.0124為高表達(dá)組，<0.0124為低表達(dá)組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，癌組織及癌旁組織中的miRNA的表達(dá)量比較采用t檢驗(yàn)，分析miRNA-221表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meir方法進(jìn)行生存分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-221在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

采用2-△△Ct法計(jì)算出miRNA-221相對(duì)內(nèi)參U6的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，相對(duì)于內(nèi)參U6，miRNA-221在NSCLC組織中的相對(duì)表達(dá)量為（0.0234±0.0002），在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量為（0.0095±0.0003），miRNA-221在NSCLC組織中的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 miRNA-221與NSCLC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

53例NSCLC組中，32例miRNA-211相對(duì)高表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，miRNA-211的表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙情況、病理類(lèi)型無(wú)關(guān)（P > 0.05）。而miRNA-221的表達(dá)與患者TNM分期有關(guān)，TNM分期Ⅲ期miRNA-221的表達(dá)量高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 不同miRNA-221水平NSCLC患者的生存分析

Kaplan-Meir生存分析結(jié)果顯示，miRNA-221高表達(dá)患者中位OS為36.4個(gè)月，miRNA-221高表達(dá)與低表達(dá)患者OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.544）。見(jiàn)圖1。

3 討論

越來(lái)越多的研究表明，miRNA可作為潛在的癌基因（OncomiR）或抑癌基因。miRNA-221和miRNA-222是兩種亮度同源的miRNA，miRNA-221屬于miRNA-221/222家族，miRNA-221編碼的基因位于染色體XP11.3[12-15]，miRNA-221與多種腫瘤有關(guān)，如miRNA-221在大多數(shù)上皮性腫瘤中過(guò)表達(dá)[16]，并且miRNA-221可能是上皮瘤治療的潛在靶點(diǎn)。Galardi等[17]研究顯示，在前列腺癌細(xì)胞中miRNA-221出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致細(xì)胞周期的改變。在惡性膠質(zhì)癌、甲狀腺乳頭狀癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌中也得到了證實(shí)。吳展陵等[18]研究結(jié)果顯示，miRNA-221過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)NSCLC NCI-H1299細(xì)胞的活力和增殖能力，P27是NCI-H1299細(xì)胞中miRNA-221的靶基因，兩者存在負(fù)調(diào)控關(guān)系，提示miRNA-221可以促進(jìn)NSCLC NCI-H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)，可作為NSCLC基因治療的靶點(diǎn)。

本研究采用qRT-PCR的方法統(tǒng)計(jì)了53例NSCLC組織及正常組織的miRNA-221表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-221在NSCLC癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，miRNA-221在NSCLC中的表達(dá)與腫瘤臨床分期相關(guān)，臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期患者miRNA-221陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于臨床分期Ⅰ、Ⅱ期。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，miRNA-221在不同年齡、性別、組織學(xué)類(lèi)型、病理特征間的表達(dá)水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），因此miRNA-221可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。另外，miRNA-221與NSCLC的預(yù)后有關(guān)，miRNA-221低表達(dá)的患者OS長(zhǎng)，呂俊杰等[19-21]研究報(bào)道，miRNA-211高表達(dá)組中位OS為35.34個(gè)月，較miRNA-221低表達(dá)組（平均48.72個(gè)月）明顯縮短，兩組OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank檢驗(yàn)：P = 0.006）。miRNA-221在一定程度上可作為NSCLC的腫瘤標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，miRNA-221高表達(dá)組患者較miRNA-221低表達(dá)組患者中位OS短，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），這與呂俊杰等[19]報(bào)道有一定差異，可能與病例來(lái)源不同或者病例數(shù)量較少有關(guān)，還需進(jìn)一步的研究。

miRNA-221對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖、周期的影響以及可能與哪種基因存在靶向調(diào)控關(guān)系，仍需進(jìn)一步研究。本研究提示miRNA-221與NSCLC細(xì)胞周期、凋亡有關(guān)，在細(xì)胞水平驗(yàn)證了miRNA-221的作用。此外，miRNA可以特異性地識(shí)別靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR），并與之結(jié)合，促進(jìn)靶基因的降解或翻譯、抑制而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用[22-24]。相關(guān)研究[25-26]報(bào)道，miRNA-221通過(guò)與靶基因PTEN的3′-UTR結(jié)合通過(guò)上調(diào)PTEN，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中起到促進(jìn)凋亡的作用，后續(xù)可進(jìn)行miRNA-221與靶基因調(diào)控作用的研究。

綜上，miRNA-221在NSCLC中的表達(dá)量明顯上調(diào)，提示miRNA-221在NSCLC中充當(dāng)癌基因作用，并且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮促癌作用，可作為一個(gè)潛在的預(yù)測(cè)預(yù)后因素。

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（收稿日期：2018-04-25 本文編輯：金 虹）