基于rGroEL和rOmpC的牙鲆遲緩愛德華氏菌 血清學(xué)診斷試紙條的制備?

王欣茹， 唐小千， 繩秀珍， 邢 婧， 戰(zhàn)文斌

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

基于rGroEL和rOmpC的牙鲆遲緩愛德華氏菌 血清學(xué)診斷試紙條的制備?

王欣茹， 唐小千??， 繩秀珍， 邢 婧， 戰(zhàn)文斌

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

本實(shí)驗(yàn)旨在制備一種基于重組抗原rGroEL和rOmpC的遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)血清學(xué)診斷試紙條，用于定性檢測(cè)牙鲆 (Paralichthysolivaceus) 血清中抗遲緩愛德華氏菌的抗體水平。前期研究發(fā)現(xiàn)分子伴侶蛋白GroEL和外膜蛋白OmpC是遲緩愛德華氏菌的重要免疫保護(hù)性抗原。本研究重組表達(dá)獲得高純度的rGRoEL和rOmpC，以其免疫健康牙鲆制備抗血清，同時(shí)制備獲得牙鲆抗遲緩愛德華氏菌全菌血清。ELISA結(jié)果顯示rGroEL和rOmpC不存在抗原交叉，抗rGroEL和rOmpC血清均可與全菌發(fā)生陽(yáng)性結(jié)合，且全菌抗血清也能識(shí)別rGroEL和rOmpC。將rOmpC、rGroEL及羊抗鼠IgG劃線于NC膜分別作為檢測(cè)線T1、檢測(cè)線T2和質(zhì)控線C，同時(shí)以制備的膠體金標(biāo)記的鼠抗牙鲆IgM單克隆抗體2D8固定于結(jié)合墊，構(gòu)建獲得膠體金免疫層析試紙條。將試紙條分別用以檢測(cè)不同稀釋度的各抗血清，檢測(cè)過(guò)程可在15 min內(nèi)完成，結(jié)果顯示制備的滅活全菌、rGroEL和rOmpC牙鲆抗血清分別最高稀釋200、600與400倍時(shí)，均可使檢測(cè)線T1與T2顯紅色。同時(shí)，以試紙條檢測(cè)牙鲆免疫全菌滅活疫苗后不同時(shí)間點(diǎn)的抗血清，結(jié)果顯示3、4、5周檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，且檢測(cè)線顏色隨著免疫后時(shí)間延長(zhǎng)而加深。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的基于重組抗原rGroEL和rOmpC遲緩愛德華氏菌血清學(xué)診斷試紙條，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果快速可見，可以定性檢測(cè)牙鲆血清中抗遲緩愛德華氏菌的抗體水平，可應(yīng)用于全菌滅活疫苗、rGroEL和rOmpC亞單位疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)，同時(shí)也具有牙鲆愛德華氏菌病的潛在診斷價(jià)值。

牙鲆； GroEL； OmpC； 遲緩愛德華氏菌； 血清學(xué)診斷； 膠體金免疫層析試紙條

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，其宿主范圍非常廣泛，不僅可以感染淡水和海水中養(yǎng)殖的多種魚類，也可感染兩棲、爬行類、海洋哺乳類動(dòng)物以及人類，其導(dǎo)致的遲緩愛德華氏菌病(Edwardsiellasis)每年給海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。因此，建立遲緩愛德華氏菌病的快速診斷方法和進(jìn)行疫苗免疫是及早預(yù)防和控制該病原菌傳播的關(guān)鍵，對(duì)于包括牙鲆(Paralichthysolivaceus)在內(nèi)的經(jīng)濟(jì)魚類的健康養(yǎng)殖有著重要的切實(shí)意義。

血清學(xué)方法是診斷和監(jiān)測(cè)動(dòng)物及人類疾病的常規(guī)方法，該方法不僅可以用于診斷病原，而且反映的抗體水平可以用來(lái)評(píng)估魚體的免疫狀況[5]。血清學(xué)的檢測(cè)方法有凝集試驗(yàn)、ELISA、中和試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)等。這些方法雖然有效，但是都需要專用儀器和專業(yè)人員，耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜[6-7]。膠體金免疫層析法(Colloidal gold immunochromatography assay, GICA)的間接法廣泛應(yīng)用于血清學(xué)檢測(cè)[8]，能快速檢測(cè)出血清中病原菌的抗體，準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可見，適用于基層養(yǎng)殖場(chǎng)的實(shí)時(shí)檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)室研究人員前期研究發(fā)現(xiàn)，分子伴侶蛋白GroEL和外膜蛋白OmpC是遲緩愛德華氏菌的免疫保護(hù)性抗原，均可誘導(dǎo)牙鲆產(chǎn)生較高水平的抗體，有較高的相對(duì)免疫保護(hù)率[9-10]，具備作為候選亞單位疫苗的潛力。本研究利用免疫保護(hù)性抗原GroEL和OmpC，結(jié)合膠體金免疫層析技術(shù)，制備基于重組抗原rGroEL和rOmpC的遲緩愛德華氏菌血清學(xué)診斷試紙條，用以定性檢測(cè)牙鲆血清中抗遲緩愛德華氏菌抗體水平，應(yīng)用于全菌滅活疫苗、rGroEL和rOmpC亞單位疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)，同時(shí)也具有牙鲆愛德華氏菌病的潛在診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

牙鲆購(gòu)自山東日照東港區(qū)海珍品研究所，體重300 g，在過(guò)濾海水中暫養(yǎng)1周，鹽度約為30，水溫為20～22 ℃，pH為7.4～7.8，期間連續(xù)充氣，每天換水一次，投喂顆粒飼料一次。

1.2 抗原的重組表達(dá)與純化

rGroEL和rOmpC抗原表達(dá)菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏[9-10]。將重組表達(dá)菌接種到含0.1% 氨芐抗生素的500 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h，收集1 mL菌體，然后加入終濃度為1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12 h后，再收集1 mL菌體。剩下的培養(yǎng)物于8 000g離心10 min后，再加入50 mL Binding buffer(8 mol/L尿素，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，30 mmol/L咪唑，調(diào)整pH至7.4)。經(jīng)過(guò)超聲破碎之后，12 000g離心5 min。樣品需要用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，然后加入鎳瓊脂糖親和層析柱，經(jīng)Binding buffer平衡后，以Elution buffer(8 mol/L尿素，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，500 mmol/L咪唑，調(diào)整pH至7.4)作為洗脫液，把洗脫下來(lái)的蛋白分步進(jìn)行收集，然后分步透析，透析液中尿素濃度從8、6、4、2至0 mol/L依次降低，中間間隔12 h更換透析液，最后以PBS透析。SDS-PAGE檢測(cè)IPTG誘導(dǎo)前后和純化后的樣品。

1.3 抗血清的制備及特性分析

遲緩愛德華氏菌從患病牙鲆體中分離并保藏[11]。根據(jù)文獻(xiàn)[12]制備遲緩愛德華氏菌全菌滅活疫苗。用無(wú)菌PBS將純化的rGroEL和rOmpC稀釋為1 mg/mL，滅活全菌調(diào)整為1.0×108CFU/mL，用注射乳化器將其與弗式完全佐劑1∶1混合后以腹腔注射的方式免疫健康牙鲆，每種疫苗接種10尾，每尾200 μL，對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水。2周后接種添加弗氏不完全佐劑的每種疫苗加強(qiáng)免疫一次。首次免疫后35天尾靜脈采血，室溫傾斜放置1 h，轉(zhuǎn)入4 ℃過(guò)夜，次日4 ℃，8 000g離心15 min獲得全菌滅活疫苗和亞單位疫苗免疫后的牙鲆血清。

間接ELISA法分析抗血清特性。取濃度為1.0×108CFU/mL滅活的遲緩愛德華氏菌、20 μg/mL rGroEL和20 μg/mL rOmpC作為包被液分別加入到酶標(biāo)板中，每孔100 μL，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，4 ℃靜置過(guò)夜。次日用PBST(含有0.5% Tween 20 的PBS緩沖液)洗滌3次，每次5 min后，每孔加入200 μL 4 %的牛血清白蛋白(BSA)，37 ℃封閉1 h。PBST洗滌后，將各免疫組血清用無(wú)菌PBS稀釋成不同濃度梯度，加入100 μL，同上孵育洗滌后，加入100 μL鼠抗牙鲆IgM單克隆抗體2D8(1∶2 000)。同上孵育洗滌后，加入100 μL堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(Sigma，1∶5 000)，37 ℃孵育45 min。完成最后一次洗滌后，每孔加入100 μL新鮮配制的硝基苯磷酸酯(pNpp)發(fā)色液，酶標(biāo)儀測(cè)量在405 nm處讀取OD值。未經(jīng)免疫的牙鲆血清作為對(duì)照組。P/N≥2.1時(shí)為陽(yáng)性。

1.4 膠體金免疫層析試紙條的制備

復(fù)蘇并培養(yǎng)分泌抗牙鲆IgM單抗的雜交瘤細(xì)胞株2D8[13]，分別腹腔注射BALB/c小鼠，采集腹水，辛酸-硫酸銨法提純獲得單抗2D8。根據(jù)文獻(xiàn)[14]制備金標(biāo)抗體，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，取0.01%氯金酸溶液100 mL，放入微波爐中，高檔火沸騰2 min，迅速一次性加入一定量的1%檸檬酸三鈉溶液，放入微波爐中，中低檔火繼續(xù)加熱3 min，冷卻至室溫，補(bǔ)足失水，制得顆粒大小為20～30 nm的膠體金，用0.1 mol/L碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金pH為8.2。將抗牙鲆IgM單抗2D8按合適的比例加入膠體金中，再加入BSA，離心純化后用金標(biāo)保存液(含1%蔗糖，1% BSA，0.1% Tween-20和0.02%疊氮鈉的0.01 mol/L PBS，pH=7.4)懸起，即為金標(biāo)單抗2D8液體。將制成的金標(biāo)單抗2D8液體噴涂到玻璃纖維上，冷凍干燥，即為載有金標(biāo)單抗2D8的金標(biāo)墊。

分別將一定濃度的rOmpC和rGroEL按照一定間距劃線于硝酸纖維素膜作為檢測(cè)線T1和T2，將0.25 mg/mL羊抗小鼠IgG劃線于硝酸纖維素膜作為質(zhì)控線，晾干，于封閉液中浸泡。在載體板上依次貼上硝酸纖維素膜、吸水墊、金標(biāo)墊和樣品墊，再用切條機(jī)切成3.7 mm寬的試紙條，裝入包裝卡殼，密封于鋁箔袋中保藏。檢測(cè)樣品時(shí)，平放試紙檢測(cè)卡，將血清用PBS進(jìn)行稀釋，向樣品孔中分別滴加檢測(cè)樣品液100 μL，等待10～15 min，肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)檢測(cè)線T1、T2顯色情況來(lái)判斷免疫情況(見圖1)。

1.5 膠體金免疫層析試紙條的應(yīng)用

將制備的牙鲆抗遲緩愛德華氏菌血清，抗rGroEL血清和抗rOmpC血清用無(wú)菌PBS分別進(jìn)行一系列濃度稀釋，向試紙條檢測(cè)卡的樣品孔中分別滴加100 μL樣品液，等待10～15 min，肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果。此外，制備遲緩愛德華氏菌滅活疫苗，免疫30尾牙鲆，分別于免疫后第0、1、2、3、4和5周隨機(jī)選取3尾牙鲆抽取外周血，室溫傾斜放置1 h后，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，次日4 ℃，8 000g離心15 min收集牙鲆抗血清，將收集的3尾牙鲆抗血清混合。用制備的試紙條檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的血清樣品，將檢測(cè)結(jié)果與間接ELISA比較。

(1：T1、T2和質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色，即表示樣品為全菌滅活疫苗免疫牙鲆的抗血清；2：T1和質(zhì)控線出現(xiàn)紅色，即表明樣品為rOmpC亞單位疫苗免疫牙鲆的抗血清；3：T2和質(zhì)控線出現(xiàn)紅色，即表明樣品為rGroEL亞單位疫苗免疫牙鲆的抗血清；4：僅出現(xiàn)質(zhì)控線時(shí)，判為陰性，表明不含特異性抗體或抗體水平低于最低檢測(cè)限；5：檢測(cè)過(guò)程中無(wú)質(zhì)控線出現(xiàn)時(shí)，表明試紙條失效。1: T1, T2 and control line were formed pink lines, which means the sample was flounder serum againstE.tarda; 2: T1 and control line were formed pink lines, which means the sample was flounder serum against rOmpC; 3: T2 and control line were formed pink lines, which means the sample was flounder serum against rGroEL; 4: Only control line was formed a pink line, which means no specific antibodies were contained in the sample or the level was too low to be detected.5:The absence of a pink line means the strip failed.)

圖1 GICA檢測(cè)結(jié)果示意圖
Fig.1 The schematic diagram of detecting results by GICA

2 結(jié)果

2.1 重組抗原rOmpC和rGroEL的制備

電泳結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的rOmpC重組表達(dá)菌和rGroEL重組表達(dá)菌的全菌蛋白中分別出現(xiàn)了相對(duì)分子量約為60 kDa(見圖2A)和65 kDa(見圖2B)的蛋白條帶，符合預(yù)期結(jié)果，而未誘導(dǎo)的重組菌中沒有出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)大小的條帶，表明目的蛋白rOmpC和rGroEL在大腸桿菌中成功表達(dá)。經(jīng)親和層析柱純化后，目的蛋白純度很高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 ELISA分析抗血清特性

ELISA結(jié)果如圖3所示，牙鲆經(jīng)免疫全菌滅活疫苗，rGroEL亞單位疫苗和rOmpC亞單位疫苗后均產(chǎn)生特異性抗體，抗血清效價(jià)分別為1 200、600和400。當(dāng)抗rGroEL血清稀釋250倍，抗rOmpC血清稀釋200倍時(shí)，均可與遲緩愛德華氏菌全菌發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)(P/N≥2.1)，而且抗全菌血清稀釋200倍時(shí)，仍可與rGroEL和rOmpC發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)。這表明抗rGroEL和rOmpC血清均可與全菌發(fā)生陽(yáng)性結(jié)合，且全菌抗血清也能識(shí)別rGroEL和rOmpC。此外，抗rGroEL血清不與rOmpC反應(yīng)，抗rOmpC血清不與rGroEL反應(yīng)，表明rGroEL與rOmpC不存在抗原交叉。

2.3 GICA檢測(cè)血清抗體水平

用制備的試紙條檢測(cè)各免疫組血清樣品，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在15 min內(nèi)完成(結(jié)果見圖4)。牙鲆抗遲緩愛德華氏菌血清稀釋50、100、150和200倍時(shí)，T1、T2和質(zhì)控線出現(xiàn)肉眼可見的紅色，檢測(cè)線顏色隨稀釋倍數(shù)的增加依次變淺，當(dāng)稀釋倍數(shù)大于200倍時(shí)，只有質(zhì)控線顯色(見圖4A)；牙鲆抗rGroEL血清分別稀釋50、100、200、300和600倍時(shí)，T2和質(zhì)控線顯色，當(dāng)稀釋倍數(shù)大于600倍時(shí)，只有質(zhì)控線顯色(見圖4B)；牙鲆抗rOmpC血清分別稀釋50、100、200和400倍時(shí)，T1和質(zhì)控線顯色，當(dāng)稀釋倍數(shù)大于400倍時(shí)，只有質(zhì)控線顯色(見圖4C)。

(A：rOmpC的重組表達(dá)及純化；B：rGroEL的重組表達(dá)及純化。M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 未誘導(dǎo)重組菌體總蛋白；2: IPTG誘導(dǎo)后重組菌體總蛋白；3: 純化后的重組蛋白。A: Expression and purification of rOmpC; B: Expression and purification of rGroEL. M: Marker; 1: Negative control without IPTG induction; 2:E.colitransfected with recombinant plasmid induced by IPTG; 3: Purified protein.)

圖2 rOmpC和rGroEL的重組表達(dá)及純化
Fig.2 Expression and purification of rOmpC and rGroEL

(A：牙鲆抗遲緩愛德華氏菌血清特性分析結(jié)果；B：牙鲆抗GroEL血清特性分析結(jié)果；C：牙鲆抗OmpC血清特性分析結(jié)果。A: The characteristic of flounder antisera againstE.tarda; B: The characteristic of flounder antisera against rGroEL; C: The characteristic of flounder antisera against rOmpC.)

圖3 ELISA分析各抗血清特性
Fig.3 The characteristic of flounder antisera analysed by ELISA

用制備的試紙條檢測(cè)全菌滅活疫苗免疫牙鲆后不同時(shí)間點(diǎn)的抗血清樣品(見圖5A)，結(jié)果顯示免疫后第0、1和2周的血清不能使檢測(cè)線顯色，結(jié)果呈陰性；第3至5周的血清能與檢測(cè)線上的蛋白結(jié)合，使之出現(xiàn)2條紅線，結(jié)果呈陽(yáng)性，且檢測(cè)線顏色隨著免疫后時(shí)間延長(zhǎng)而加深。間接ELISA結(jié)果顯示(見圖5B)，包被滅活全菌來(lái)檢測(cè)免疫后不同時(shí)間點(diǎn)的抗血清時(shí)，從第2周開始特異性抗體的顯著增高，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(P/N≥2.1)，但是特異性抗體水平不是很高，抗rGroEL和rOmpC的抗體含量也不多，所以包被重組蛋白來(lái)檢測(cè)抗血清時(shí)，從第3周開始樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，這與試紙條檢測(cè)結(jié)果一致。

(A：牙鲆抗遲緩愛德華氏菌血清抗體水平測(cè)定結(jié)果; B: 牙鲆抗rGroEL血清抗體水平測(cè)定結(jié)果; C：牙鲆抗rOmpC血清抗體水平測(cè)定結(jié)果?！?”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。A: Detecting the antibody levels of flounder serum againstE.tarda; B: Detecting the antibody levels of flounderserum against rGroEL. C: Detecting the antibody levels of flounderserum against rOmpC; “ + ” show positive, “-” show negative.)

圖4 GICA檢測(cè)各免疫組血清抗體水平
Fig.4 Detecting the antibody levels of flounder antisera by GICA

(A：GICA檢測(cè)牙鲆免疫全菌滅活疫苗后不同時(shí)間點(diǎn)的抗血清結(jié)果；B：ELISA檢測(cè)牙鲆免疫全菌滅活疫苗后不同時(shí)間點(diǎn)的抗血清結(jié)果?！?”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。A: Detecting the changes of specific antibody in flounder serum after immunized with inactivatedE.tardaby GICA; B: Detecting the changes of specific antibody in flounder serum after immunized with inactivatedE.tardaby ELISA. “ + ” show positive, “-” show negative.)

圖5 GICA和ELISA檢測(cè)牙鲆免疫全菌滅活疫苗后特異性抗體水平的變化
Fig.5 Detecting the changes ofspecific antibody in flounder serum after immunization by GICA and ELISA

3 討論

GroEL是一個(gè)高度保守的分子伴侶，屬于HSP60家族，存在于細(xì)菌外膜和分泌組中，對(duì)蛋白質(zhì)的正確折疊和組裝至關(guān)重要[15-16]。OmpC是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜上的孔道蛋白，在菌體上豐度高，是主要的表面抗原[17]。實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示，遲緩愛德華氏菌的GroEL和OmpC都是重要的免疫保護(hù)性抗原，具有良好的免疫原性，能引起魚體較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異的保護(hù)性抗體。本研究制備了牙鲆抗rGroEL血清、抗rOmpC血清以及抗遲緩愛德華氏菌血清，間接ELISA法分析各抗血清特性表明，rGroEL和rOmpC不存在抗原交叉，推測(cè)二者結(jié)構(gòu)差異大，抗原決定簇相似度低。此外，依據(jù)抗rGroEL和rOmpC血清均可與全菌發(fā)生陽(yáng)性結(jié)合，且全菌抗血清也能識(shí)別rGroEL和rOmpC，表明重組蛋白與天然結(jié)構(gòu)相似度高，與之前的研究結(jié)果一致[9-10]。因此，rGroEL和rOmpC可以作為捕獲蛋白用于定性檢測(cè)牙鲆血清中抗遲緩愛德華氏菌的抗體。本實(shí)驗(yàn)暫未探究rGroEL和rOmpC與其他屬細(xì)菌的抗原交叉性，這兩蛋白可能還具有牙鲆遲緩愛德華氏菌病的潛在診斷價(jià)值。

膠體金免疫層析試紙具有容易攜帶、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果肉眼可見、不需要專業(yè)人員和設(shè)備、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常有發(fā)展前景的即時(shí)檢測(cè)技術(shù)。重組抗原的成分單一，能減少非特異性反應(yīng)，且容易大量獲得，利于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)分別把rGroEL和rOmpC作為試紙條的檢測(cè)線，若樣品中含有抗遲緩愛德華氏菌的抗體，2條檢測(cè)線均會(huì)顯色，相比單一蛋白，該方法更加準(zhǔn)確。將試紙條用于全菌滅活疫苗和rGroEL、rOmpC亞單位疫苗免疫牙鲆后的抗體水平檢測(cè)，結(jié)果表明試紙條的靈敏度與ELISA相當(dāng)，而試紙條操作更簡(jiǎn)單、省時(shí)且結(jié)果可見。同時(shí)將試紙條用于檢測(cè)牙鲆免疫遲緩愛德華氏菌全菌滅活疫苗后血清中不同時(shí)間點(diǎn)的特異性抗體水平，可依據(jù)檢測(cè)線顯色的程度來(lái)評(píng)估免疫后特異性抗體水平高低，適用于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)遲緩愛德華氏菌疫苗免疫效果的快速評(píng)價(jià)。疫苗中GroEL和OmpC的抗原性存在，便可使用該試紙條，不僅是遲緩愛德華氏菌全菌滅活疫苗、rGroEL和rOmpC亞單位疫苗，減毒疫苗免疫牙鲆后，也可使用該試紙條定性檢測(cè)特異性抗體水平。此外，若膠體金標(biāo)記其他養(yǎng)殖魚類IgM的抗體，則基于rGroEL和rOmpC的試紙條還可拓展應(yīng)用于更多魚類血清中遲緩愛德華氏菌特異性抗體的檢測(cè)。

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)制備的基于rGRoEL和rOmpC的遲緩愛德華氏菌血清學(xué)診斷試紙條，準(zhǔn)確靈敏，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果易于判讀，可以定性檢測(cè)牙鲆血清中抗遲緩愛德華氏菌的抗體水平，適用于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)中快速評(píng)價(jià)遲緩愛德華氏菌全菌滅活疫苗、rGroEL和rOmpC亞單位疫苗的免疫效果，同時(shí)也具有診斷牙鲆愛德華氏菌病的潛在價(jià)值。

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DevelopmentofColloidalGoldImmunochromatographyAssayStripforrGroELandrOmpCBasedSerologicalDiagnosisofEdwardsiellosisinFlounder(Paralichthysolivaceus)

WANG Xin-Ru, TANG Xiao-Qian, SHENG Xiu-Zhen, XING Jing, ZHAN Wen-Bin

(The Key Laboratory of Mariculture (Ocean University of China), Ministry of Education,Qingdao 266003, China)

The aim of this workwas to develop a colloidal gold immunochromatography assay strip for the qualitative detection of the antibody againstEdwardsiellatardain flounder serum by using recombinant GroEL (rGroEL) and recombinant outer membrane protein C (rOmpC). In our previous study, molecular chaperone GroEL and OmpCofE.tardawere identified to be the important immune protective antigens. In the present work, high purerGroEL and rOmpC were prepared by inducing constructed recombinantE.coliand immunized flounder to get the antisera. Flounder antisera againstE.tardawere also prepared. The results of ELISA assay showed that no antigenic cross-reactivity was observed between rGroEL and rOmpC, whereas antibodies induced by rGroEL and rOmpC could react withE.tarda, and the rGroEL and rOmpC could be also recognized by flounder anti-E.tardaantibodies. To develop the immunochromatography test strip, rOmpC, rGroEL and goat anti-mouse IgG were immobilized on the nitrocellulose membrane as test line 1 (T1), test line 2 (T2) and control line (C), meanwhile, colloidal gold labelled with monoclonal antibody against flounder IgM 2D8 was fixed on the bonding pad. The strips were then used to detect antisera with different dilutions, which appeared pink color lines at T1 and T2 positions within 15 min when the antisera againstE.tarda, rGroEL and rOmpC with the highest dilutions of 200, 600 and 400 folds, respectively. Meanwhile, the strips were applied to test the antisera that were collected at different weeks after immunization with inactivatedE.tarda, which showed positive results at week 3, 4 and 5, and the intensity of pink lines on test linesbecame deeper with the time after immunization. These results demonstrated that the test strips developed in this work have the advantages of rapid, easy operation and visible results for qualitative detection of the antibody againstE.tarda, which would be applied in evaluating the immune effects of inactivatedE.tardavaccine and subunit vaccines of rGroEL and rOmpC. In addition, it also has the potential value in diagnosis of edwardsiellosis in flounder.

Paralichthysolivaceus; GroEL; OmpC;Edwardsiellatarda; serological diagnosis; colloidal gold immunochromatography assay

S91

A

1672-5174(2018)02-032-06

10.16441/j.cnki.hdxb. 20170037

王欣茹， 唐小千， 繩秀珍, 等. 基于rGroEL和rOmpC的牙鲆遲緩愛德華氏菌血清學(xué)診斷試紙條的制備[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2018, 48(2): 32-37.

WANG Xin-Ru, TANG Xiao-Qian, SHENG Xiu-Zhen,et al. Development of colloidal gold immunochromatography assay strip for rGroEL and rOmpC based serological diagnosis of edwardsiellosis in flounder (Paralichthysolivaceus) [J].Periodical of Ocean University of China, 2018, 48(2): 32-37.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31672685; 31672684; 3142295)；泰山學(xué)者特聘專家項(xiàng)目資助

Supported by National Natural Science Foundation of China (31672685; 31672684; 3142295); Taishan Scholar Program of Shandong Province

2017-01-20；

2017-03-18

王欣茹(1993-)，女，碩士生，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫學(xué)研究。

? ? 通訊作者：E-mail：tangxq@ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 朱寶象