高通量測序技術在腸道微生物宏基因組學研究中的應用

孫鳳春 王微 王靖

【摘要】用宏基因組技術研究不同比例鋸末牛糞堆肥產(chǎn)物中微生物的組成和分布。結果表明，牛糞與鋸末質量比為2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1的3個堆肥樣本中微生物可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）有較大的差異，其中含量最高的3個門的微生物為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，在不同樣本中它們的含量也有較大差異。從屬水平分析，含量最高的是甲基單胞菌屬、噬氫菌屬、固氮菌屬和寡養(yǎng)單胞菌等營養(yǎng)轉化和合成的菌屬。降解纖維素和木質素的也有一定的含量，特別是假單胞菌屬含量較高。經(jīng)過對堆肥產(chǎn)物基本性質及其微生物的分析發(fā)現(xiàn)，當牛糞與鋸末的比例為2 ∶1時，堆肥樣品中的營養(yǎng)轉化和合成菌屬以及去除污染菌屬都高于其他2個樣品，堆肥效果較好。

【關鍵詞】牛糞堆肥；宏基因組；微生物；鋸末；可操作分類單元（OUT）；分子生態(tài)學依據(jù)

【中圖分類號】R181.3+2 【文獻標識碼】B 【文章編號】2095-6851（2018）10-051-02

近年來，由于產(chǎn)業(yè)結構調(diào)整，我國規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速。以生產(chǎn)牛奶為主的奶牛養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了可觀的經(jīng)濟效益，但是同時也帶來了大量的牛糞等固體有機廢棄物，為了保護環(huán)境、實現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，必須進行牛糞的無害化處理和資源化利用，堆肥處理是目前有機固體廢物處理的重要方式。堆肥的本質是微生物群落結構演替協(xié)同作用于堆肥基質的生化過程。在細菌和真菌等微生物的作用下，降解有機物，殺死病原菌，促進有機質穩(wěn)定化和腐殖化，最終達到無害化和資源化的目的，并生成大量可被植物吸收利用的有效態(tài)氮、有效態(tài)磷、有效態(tài)鉀化合物和其他有機物質作為土壤肥力活性物質。因此，研究微生物的群落結構對于了解微生物的協(xié)同關系、調(diào)控堆肥以及研究高效穩(wěn)定的復合菌系都有重要意義。堆肥過程中的微生物菌系復雜，變化較大，而且其中大多數(shù)菌系不能分離培養(yǎng)，因而常規(guī)的試驗方法和手段難以完全認識和真實反映微生物的群落組成。宏基因學技術分析克服了傳統(tǒng)微生物分析僅限于可分離培養(yǎng)組分的缺陷，通過對樣品中微生物基因序列的分析，可以快速確定微生物的種類和豐度，主要采用16S rDNA序列分析進行微生物的群落分析檢測出樣品中大量的低豐度生物。目前，宏基因組學技術已經(jīng)應用于海洋、土壤、石油以及人體胃腸道等多個方面，但用于堆肥研究的較少。在牛糞堆肥中，通常以農(nóng)作物秸稈、木質、鋸末廢棄物等作為輔料，起到加速堆肥過程和保證堆肥效果的作用。本研究就地取材，在牛糞中添加不同比例的鋸末，采用宏基因組學技術對不同比例鋸末添加產(chǎn)生的微生物進行對比分析，旨在明確堆肥微生物的群落組成，合理評價堆肥效果，為堆肥工藝研究應用提供一定的分子生態(tài)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 堆肥試驗及樣品采集

試驗所用的牛糞和鋸末分別從湖南省武漢市南湖養(yǎng)殖場和永宏木材加工廠收集（鋸末作為調(diào)節(jié)劑）。堆肥試驗在實驗室內(nèi)進行，以鋸末為調(diào)理劑，與牛糞充分混合后進行堆肥試驗，設置柱體高度為0.8 m，直徑為0.5 m，實行人工翻堆通氣，每3 d進行1次手工翻堆。在3個相同的堆肥容器內(nèi)，將牛糞與鋸末分別按照2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1比例混合，堆肥45 d時取樣，分別在每個柱體的上、中、下采集樣品，然后將3個取樣點的樣品混合為1個樣品，3個堆肥容器所取的樣品分別編號為1、2、3號樣品。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

1.2.1 測序獲得序列的質量控制在試驗過程中，測序產(chǎn)物可能含有非特異性擴增片段，利用特異性引物信息可以將其去除；序列中可能含有模糊堿基、單堿基高重復區(qū)以及PCR過程中產(chǎn)生的一些嵌合體，將這些序列納入分析范圍會降低分析質量，因此去除此部分序列，可得到供精準分析的優(yōu)化序列。

1.2.2 可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）分析首先提取非重復序列，堿基完全一致序列為重復序列只保留1條；然后與SILVA v119數(shù)據(jù)庫（http：//www.arb-silva.de/）中的aligned（16S/18S，SSU）核糖體序列比對，使用uchime軟件檢測PCR擴增中產(chǎn)生的嵌合體序列（Chimeric序列）并去除嵌合體序列；最后使用mothur V.1.33.3軟件進行距離計算與OTU聚類分析。OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學或群體遺傳學研究中為了便于分析，人為給某一個分類單元（品系、屬、種、分組等）設置的同一標志。要了解一個樣品測序結果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就須要對序列進行聚類操作（cluster）。通過聚類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，1個小組就是1個OTU?？筛鶕?jù)不同的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，通常在97%的相似水平下對OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。在進行OTU分類學分析時，首先將每一條優(yōu)質序列都與數(shù)據(jù)庫進行比對，找出其最相近且可信度達80%以上的種屬信息；之后將每一個OTU中的所有序列進行類比，找出同一OTU中不同序列的最近祖先的種屬信息。將OTU綜合分類表中的信息按照門、綱、目、科、屬、種6個水平分別提取信息，分別統(tǒng)計各樣品在不同分類水平上的相對豐度。

2 討論

腸道疾病最有效的檢查方法是結腸鏡檢查，診斷和干預治療效果好，但是腸鏡直接插入體內(nèi)，會給患者帶來許多不適和疼痛，會給予患者生理上和心理上的傷害，隨著醫(yī)療水平的提高，腸鏡的使用，有效改善了腸道疾病的診斷和治療，但是其并發(fā)癥等方面還有著局限性。

在結腸鏡檢查前的腸道準備中實施綜合性護理干預，臨床價值非常明顯，本研究中觀察組腸道清潔度高，腸鏡檢查所需時間少，一次插鏡成功率高（98.59%、80.28%），并發(fā)癥發(fā)生率低（9.86%、35.21%），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。表明在結腸鏡診療前腸道準備中，護理方法不同，腸道清潔度不同，應綜合考慮患者的病情，實施個體化護理，促進患者腸蠕動，以期提高結腸鏡檢查效果。

綜上所述，綜合護理干預在結腸鏡診療前腸道準備中臨床效果良好，提高了腸道清潔度，縮短了檢查時間，降低了并發(fā)癥的發(fā)生，促進患者早日康復出院，值得臨床推廣。

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