Tiaml和E-cadherin在非肌層浸潤性膀胱癌組織中的表達(dá)及其與復(fù)發(fā)的關(guān)系

蘇宏偉，李婷，凌海濱，劉軍超，曹娟，李晨，劉鑫，李向東

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000；2張家口市第二醫(yī)院)

膀胱癌是泌尿系最常見惡性腫瘤,在世界范圍，膀胱癌發(fā)病率占男性惡性腫瘤的第7位；在歐美，膀胱癌發(fā)病率占男性惡性腫瘤第4位；在我國，膀胱癌發(fā)病率占男性惡性腫瘤第7位，其中非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)占初發(fā)腫瘤70%[1]。NMIBC指腫瘤位于膀胱黏膜及固有層，未侵及肌層的膀胱癌，常采用保留膀胱的治療方式，如經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)，術(shù)后輔以膀胱灌注化療；但術(shù)后有30%～50%患者可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)，目前臨床上采用的分級(jí)分期方法很難準(zhǔn)確預(yù)測其復(fù)發(fā)。尋找有效的分子標(biāo)志物來早期、精確預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)或進(jìn)展是當(dāng)前NMIBC的研究熱點(diǎn)[2]。我們采用免疫組化法探討T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(Tiam1)、E鈣黏蛋白(E-cad)水平與NMIBC臨床特點(diǎn)的相關(guān)性,以期為臨床判斷預(yù)后提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2005～2013年經(jīng)病理證實(shí)且獲得隨訪的NMIBC患者116例，男71例、女45例,年齡37～82(56±7.63)歲。腫瘤單發(fā)67例，其中位于左側(cè)壁23例、右側(cè)壁21例、后壁18例、前壁5例，多發(fā)49例；腫瘤直徑0.5～3 cm，其中直徑≤2 cm 80例、>2 cm 36例，膀胱癌病理分級(jí)(WHO/ISUP, 1998):低分級(jí)(G1～G2) 85例,高分級(jí)(G3) 31例。另外，選取年齡與NMIBC患者相匹配的前列腺增生患者50例作為對照組。

1.2 NMIBC治療及隨訪 均采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)。德國STORZ 30°電切鏡，術(shù)中甘露醇持續(xù)膀胱灌注，小于1 cm腫瘤予以整塊切除，大于1 cm腫瘤分次切除，切除范圍包括腫瘤及其周圍1 cm膀胱壁，切除腫瘤后常規(guī)切除肌層，分層送病理，術(shù)后病理證實(shí)無膀胱肌層浸潤。術(shù)后24 h內(nèi)膀胱灌注表阿霉素(海正輝瑞公司)50 mg，保留40 min后排出，以后每周1次，8次后改為每月1次，共20次。術(shù)后前兩年每3個(gè)月復(fù)查膀胱鏡，2年后改為每半年復(fù)查1次，觀察腫瘤復(fù)發(fā)情況，術(shù)后隨訪均在5年以上。

1.3 膀胱癌及正常膀胱組織中Tiam1、E-cad表達(dá)的檢測 采用免疫組化SP法。鼠抗人Tiam1、E-cad單克隆抗體購自Santa Cruz公司。SP試劑盒購自北京中山生物制品有限公司。PBS液代替一抗作為陰性對照，已知胃癌陽性細(xì)胞作為陽性對照。收集NMIBC及前列腺增生患者恥骨上前列腺切除術(shù)中膀胱黏膜標(biāo)本，以10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后，切成厚度為4 μm的切片，首先進(jìn)行HE染色，確定組織分化程度，然后再次切片，二甲苯和乙醇脫蠟水化，加入pH 7.4、濃度為0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。以非免疫血清封閉后，加入一抗孵育，4 ℃過夜，再加入二抗，孵育20 min。加入鏈霉菌素(辣根酶標(biāo)記)溶液反應(yīng)10 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水封片后，顯微鏡觀察每個(gè)組織的細(xì)胞著色情況，隨機(jī)選取5個(gè)視野。蛋白表達(dá)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：Tiam1蛋白陽性染色為在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中呈黃色或棕色顆粒，E-cad蛋白陽性染色為在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中呈黃色或棕色顆粒，邊界清楚，背景無明顯染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。膀胱癌不同蛋白表達(dá)與臨床參數(shù)間關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，Tiam1、E-cad與膀胱癌組織與正常組織間表達(dá)比較采用Fisher’s精確概率法，Tiam1與E-cad之間相關(guān)性采用Pearson列聯(lián)系數(shù)，隨訪資料復(fù)發(fā)分析采用生存率曲線(Kaplan-Meier法)，用Log-rank檢驗(yàn)判斷差異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織Tiam1蛋白、E-cad蛋白表達(dá)比較 Tiam1在正常膀胱及NMIBC組織中均有表達(dá)，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃色或棕色顆粒；正常膀胱組織中Tiam1表達(dá)陽性率為14%(7/50)；NMIBC標(biāo)本中,Tiam1表達(dá)陽性率為39.66%(46/116)；兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.036，P<0.05)。E-cad在正常膀胱及NMIBC組織中均有表達(dá)，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃色或棕色顆粒；正常膀胱組織中E-cad表達(dá)陽性率為10.00%(5/50)；NMIBC組織中,E-cad表達(dá)陽性率為63.79%(74/116)；兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.603,P<0.05)。

2.2 癌組織中Tiam1、E-cad蛋白表達(dá)與NMIBC患者臨床病理特征的關(guān)系 癌組織中Tiam1蛋白表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)、復(fù)發(fā)有關(guān)(P均<0.05)，與性別、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑無關(guān)(P均>0.05)；E-cad蛋白表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)、復(fù)發(fā)有關(guān)(P均<0.05)，與性別、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 癌組織中Tiam1、E-cad蛋白表達(dá)與NMIBC患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 NMIBC預(yù)后的多因素分析 定義復(fù)發(fā)(0=否，1=是)為自變量，Tiam1(0=陰性，1=陽性)、E-cad(0=陰性，1=陽性)、性別(0=男性，1=女性)、病理分級(jí)(0=G1～G2，1=G3)、腫瘤數(shù)目(0=單發(fā)，1=多發(fā))、腫瘤直徑(0=≤2 cm，1=>2 cm)為因變量進(jìn)行COX回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤病理分級(jí)及Tiam1、E-cad陽性是復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，見表2。

表2 NMIBC預(yù)后的多因素COX回歸分析

2.4 NMIBC組織中Tiam1與E-cad蛋白表達(dá)的關(guān)系 116例NMIBC患者中，Tiam1蛋白表達(dá)陽性46例，其中E-cad蛋白表達(dá)陽性26例；Tiam1蛋白表達(dá)陰性70例，其中E-cad蛋白表達(dá)陽性54例，Tiam1蛋白表達(dá)與E-cad蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(χ2=-9.046，P=0.000)。

2.5 組織中Tiam1、E-cad表達(dá)與復(fù)發(fā)的關(guān)系 根據(jù)腫瘤標(biāo)記物不同表達(dá)進(jìn)行分組，分為Tiam1(+)E-cad(+)(A組，簡稱T+E+，以下同)、T+E-(B組)、T-E+(C組)、T-E-(D組)四組。其中A組20例，復(fù)發(fā)率50%(10/20)；B組26例，復(fù)發(fā)率65.38%(17/326)；C組54例，復(fù)發(fā)率25.93%(14/56)；D組26例，復(fù)發(fā)率37.5%(6/26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較其他三組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)(見圖1)。

圖1 Tiam與E-cad不同表達(dá)組的復(fù)發(fā)率曲線

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，約占8%，大多數(shù)為NMIBC，臨床治療以手術(shù)為主，術(shù)后輔助膀胱灌注化療，但有30%～50%出現(xiàn)復(fù)發(fā)。如何預(yù)測復(fù)發(fā)是困擾臨床醫(yī)生的一大難題。

E-cad是細(xì)胞間黏附連接的重要黏附分子，是廣泛分布于胚胎組織及成年人組織上皮細(xì)胞中的黏附因子，在實(shí)體腫瘤發(fā)生、形成、浸潤、復(fù)發(fā)過程中起著至關(guān)重要作用，尤其是對維持細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞間黏附的調(diào)節(jié)起重要作用[3]。許多腫瘤的生物學(xué)特性與E-cad的不正常表達(dá)和(或)低表達(dá)密切相關(guān)，其表達(dá)陰性可促進(jìn)膀胱癌復(fù)發(fā)、進(jìn)展[4]。

Tiam1是等于1994年從鼠的T淋巴瘤中分離出來的一種腫瘤轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因，其產(chǎn)物Tiam1蛋白作為鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子，可特異性激活Rac-1，并通過Tiam-Rac1信號(hào)途徑改變腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和功能，從而調(diào)節(jié)并誘導(dǎo)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。最近研究表明，Tiam1通過激活骨橋蛋白-CD44-Tiam1-Rac1通路抑制腫瘤抑制基因Rho GD12，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散[6]。大量研究顯示，Tiam1在多種腫瘤包括肺癌[7]、胃腺癌[8]、腎細(xì)胞癌[9，10]、浸潤性乳腺導(dǎo)管癌[11]中異常高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、惡性程度及預(yù)后關(guān)系密切。但Tiam1與膀胱癌的關(guān)系尚不明確。

Tiam1介導(dǎo)的Rac1激活可促進(jìn)E-cad介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附。E-cad及Tiam1表達(dá)異常與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)，而且不同腫瘤組織中Tiam1表達(dá)不同[4]。在膀胱癌組織中可發(fā)現(xiàn)E-cad表達(dá)異常[4]，但Tiam1與E-cad在膀胱癌組織中是否存在異常表達(dá)尚未見報(bào)道。

本研究結(jié)果表明，NMIBC組織中E-cad及Tiam1均有不同程度表達(dá)，其異常表達(dá)與膀胱癌病理分級(jí)及復(fù)發(fā)有關(guān)；低級(jí)別NMIBC腫瘤組織中E-cad表達(dá)陽性率高于高級(jí)別腫瘤組織；相反，Tiam1在低級(jí)別腫瘤組織中表達(dá)陽性率低于高級(jí)別腫瘤組織；與此對應(yīng)，與非復(fù)發(fā)病例比較，復(fù)發(fā)病例中，Tiam1表達(dá)高、E-cad表達(dá)低；提示Tiam1在NMIBC腫瘤組織中的作用與E-cad相反，E-cad作為重要的細(xì)胞間黏附因子，表達(dá)陰性可促進(jìn)膀胱癌復(fù)發(fā)、進(jìn)展。進(jìn)一步分析表明，在NMIBC組織中Tiam1陽性及E-cad陰性的患者復(fù)發(fā)率更高，推測聯(lián)合檢測Tiam1及E-cad會(huì)更準(zhǔn)確地預(yù)測膀胱癌是否復(fù)發(fā)。

目前關(guān)于E-cad在膀胱癌中的作用已有很多研究，均表明其作為抑癌基因存在，但Tiam1在膀胱癌中的作用機(jī)制尚不十分清楚，進(jìn)一步研究Tiam1在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的意義，將為降低膀胱癌復(fù)發(fā)或進(jìn)展提供新的臨床思路;同時(shí)，敲除該基因是否會(huì)控制膀胱癌發(fā)生，將是我們今后研究的目標(biāo)。