兔脊柱結(jié)核模型中結(jié)核分支桿菌對人工骨與鈦金屬的黏附性比較

孫厚杰,鄢陵,蔡小軍,韓建華,范華華,李代君

(遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義536000)

植骨融合內(nèi)固定技術(shù)在脊柱結(jié)核病灶清除后能有效修復(fù)骨缺損、維持脊柱正常序列、重建脊柱穩(wěn)定性[1，2]。但植骨材料的選擇一直困擾著業(yè)內(nèi)專家、學(xué)者。自體骨取骨量大、患者痛苦。異體骨排異反應(yīng)、可能導(dǎo)致疾病傳播。二者的廣泛應(yīng)用受到一定限制。目前利用鈦金屬作為植骨支撐材料用于結(jié)核病灶內(nèi)已被多數(shù)專家學(xué)者所接受[3，4]，但缺點(diǎn)是由于接觸界面硬度不一致導(dǎo)致的鈦網(wǎng)下沉及X射線遮擋效應(yīng)等不利于觀察融合效果。近年，n-HA/PA66復(fù)合材料在修復(fù)非感染性骨缺損方面得到良好的應(yīng)用，是一種安全而有效植骨填充材料[5]。但其能否像鈦金屬一樣安全應(yīng)用在結(jié)核性骨缺損中關(guān)鍵在于結(jié)核分支桿菌對該材料有無黏附性及黏附力強(qiáng)弱。2016年1月～2018年2月，我們通過建立動(dòng)物結(jié)核模型觀察結(jié)核分支桿菌對兩種植骨材料的黏附情況，比較脊柱結(jié)核病灶清除后兩種不同材料人工骨植入的安全性問題。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：健康新西蘭白兔35只(SPF級(jí))，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～3.0 (2.65±0.25)kg，由遵義醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物經(jīng)嚴(yán)格消毒，飼養(yǎng)條件：溫度(23±3)℃，相對濕度70%±10%，采用兔標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)飼料飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)植骨材料：人型結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv)由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供；n-HA/PA66復(fù)合生物材料人工骨由四川國納科技有限公司提供；鈦金屬材料由山東威高醫(yī)療器械有限公司提供；氯胺酮(0.1 g/2 mL)由福建古田藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；安定(10 mg/2 mL)由天津金耀藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；阿托品(0.5 mg/mL)由天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物攻毒建模術(shù) 模型制備主要參照文獻(xiàn)[6]建模方法，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[7～9]和實(shí)際情況有所改進(jìn)建立模型。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用氯胺酮、安定、阿托品聯(lián)合麻醉[氯胺酮、安定、阿托品按2∶2∶1(容積比)比例配制，生理鹽水稀釋1倍，用量約為2.5 ml/kg，耳緣靜脈緩慢靜注)]，麻醉成功后，左側(cè)臥位固定在兔專用固定器上，右側(cè)腰背部脫毛、備皮，備皮直徑約6 cm，術(shù)區(qū)消毒、鋪巾，采用無菌器械沿右側(cè)第12肋末向下至髂嵴作約6 cm縱切口的側(cè)方入路，顯露腰5、6椎體。于腰5椎體下緣近下終板處，從右前上方向左后下方，與椎體近端呈60°進(jìn)入，鉆孔(L: 0.5 cm、r: 0.25 cm)，在注入結(jié)核分支桿菌前先加用硬化劑，然后填入醫(yī)用明膠海綿，用注射器緩慢向明膠海綿中注入結(jié)核菌懸液(菌量: 107CFU/mL)0.1 mL，用骨蠟封閉骨鉆孔，防止結(jié)核分支桿菌向周圍血液及組織擴(kuò)散，采用1-0絲線間斷縫合切口，皮下涂灑注射用青霉素粉劑(80萬U/只)，無菌紗布覆蓋切口，固定，動(dòng)物術(shù)后單獨(dú)隔離飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。術(shù)后2個(gè)月內(nèi)觀察動(dòng)物一般狀態(tài)，如進(jìn)食、活動(dòng)、精神狀態(tài)、體溫、體質(zhì)量等。密切注意切口情況(有無感染，如感染則立即淘汰)。術(shù)后當(dāng)日及每周1次檢測血ESR、CRP，監(jiān)測有無結(jié)核感染情況。術(shù)后當(dāng)日、1個(gè)月、2個(gè)月進(jìn)行X線片檢查，觀察造模區(qū)域有無膿腫和死骨形成，如有則記錄病灶數(shù)目、范圍、骨質(zhì)破壞程度。X線檢查應(yīng)統(tǒng)一曝光參數(shù)：正位片(44 kV、9.0 mAs、投照距離110 cm)，側(cè)位片(45 kV、8.0 mAs、投照距離110 cm)。

1.3 分組及處理 將20只建模成功動(dòng)物模型按成功時(shí)間序列號(hào)分成鈦金屬植入組和人工椎體植入組，每組10只。麻醉及顯露同攻毒建模術(shù)，適當(dāng)清理周圍軟組織膿液與壞死組織(勿過度清理病灶以免影響結(jié)核分支桿菌正常黏附)，制備內(nèi)置物植入空間，將嚴(yán)格滅菌消毒的微型鈦板和n-HA/PA66人工骨材料，分別植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)核病灶內(nèi)，縫合處理同建模。術(shù)后當(dāng)日及每周檢測1次體溫，血漿ESR、CRP，了解結(jié)核病灶進(jìn)展情況。

1.4 材料表面黏附細(xì)菌數(shù)目觀察 植入內(nèi)植物2個(gè)月后,采用過量的異戊巴比妥鈉麻醉處死，原切口進(jìn)入術(shù)區(qū)，大體觀察結(jié)核病灶進(jìn)展情況、周圍軟組織變化、有無膿腫及膿腫大小。通過掃描電鏡觀察鈦金屬、人工骨表面有無細(xì)菌黏附、聚集及產(chǎn)生類似生物保護(hù)膜。取出植入材料后，先用PBS緩沖液沖洗5遍，以除去表面未黏附的細(xì)菌。然后放置于4%戊二醛溶液中固定4 h以上，再用乙醇梯度脫水(依次為50%、70%、80%、90%濃度)，自然干燥后噴金鍍膜備用。掃描電鏡下，每塊材料隨機(jī)抽取20個(gè)觀察區(qū)，每個(gè)觀察區(qū)面積為50 μm×50 μm，累計(jì)材料表面所黏附細(xì)菌數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 造模后8周內(nèi)動(dòng)物體溫、ESR及CRP變化 椎體下終板鉆孔后填塞明膠海綿，注入結(jié)核菌株。建模2個(gè)月后模型兔出現(xiàn)黃白色腰大肌膿腫，膿腫內(nèi)有砂礫樣感，X線顯示腰5椎體明顯骨破壞，累及腰6上終板及腰5～6椎間隙。造模后，動(dòng)物血ESR在第1周明顯上升，以后逐漸降低，血CRP逐漸降低，體溫在第1周有短暫升高后逐漸回落，說明在造模過程中結(jié)核分支桿菌植入成功，無其他病原體感染。見表1。

2.2 兩組掃描電鏡觀察結(jié)果 結(jié)核分支桿菌對兩種植骨材料的黏附數(shù)量均很少，說明對兩種材料的黏附性較弱，細(xì)菌呈棒/桿狀、“Y”、“r”或“L”形，均未形成明顯保護(hù)膜及黏質(zhì)樣物；人工材料其表面所黏附菌量較鈦網(wǎng)表面多。見圖1。

表1 建模成功模型8周內(nèi)ESR、CRP、體溫變化

圖1 掃描電鏡檢查結(jié)果

注：a電鏡觀察鈦金屬表面結(jié)核分支桿菌黏附情況；b電鏡下人工骨材料表面結(jié)核分支桿菌黏附情況。

2.3 兩組結(jié)核分支桿菌黏附數(shù)量比較 鈦金屬植入組結(jié)核分支桿菌數(shù)量為(81.10±3.81)個(gè)，人工椎體植入組為(97.80±5.14)個(gè)。兩組比較，P=0.211。

3 討論

目前脊柱結(jié)核外科治療的經(jīng)典術(shù)式為病灶清除植骨融合內(nèi)固定術(shù)[10]。植骨材料主要有自體骨、異體骨和人工替代材料。前二者受到一定限制，自體骨易發(fā)生供骨區(qū)感染及取骨量的限制，而異體骨易發(fā)生宿主反應(yīng)及疾病傳播，故人工替代材料的發(fā)現(xiàn)尤為重要。Oga等[11]從細(xì)菌黏附的角度研究表明，與金葡菌比較，結(jié)核分支桿菌不易黏附金屬異物表面，抗結(jié)核藥物仍能起作用。后來Ha等[12]的研究也為結(jié)核病灶中植入鈦合金材料的安全可行性提供了理論依據(jù)：鈦金屬組織相容性好，取材方便，支撐固定可靠，無自體骨及異體骨生物學(xué)方面限制；結(jié)核分支桿菌對鈦合金的親和力、黏附性小，不易形成生物膜。所以，作為植骨支撐材料，鈦網(wǎng)已被普遍用于脊柱結(jié)核病灶清除后植骨融合環(huán)節(jié)。研究[13,14]發(fā)現(xiàn)，鈦網(wǎng)也有其不足及應(yīng)用限制，如接觸界面硬度不一致，鈦網(wǎng)下沉，使前柱高度有一定的減失，減失速率一般為4°～6°/2年；同時(shí)，鈦金屬對X射線的遮擋效應(yīng)導(dǎo)致不利于觀察植骨融合效果，故尋求發(fā)現(xiàn)更優(yōu)良的植骨材料成為國內(nèi)外學(xué)者探求的目標(biāo)。

植骨材料相關(guān)感染是導(dǎo)致植骨融合失敗的主要原因，而此類感染與細(xì)菌對材料的黏附密切相關(guān)，如細(xì)菌形成保護(hù)性生物膜則造成感染持續(xù)不愈，治療失敗。植物材料置入體內(nèi)后，表面很快被覆蓋各種吸附蛋白，細(xì)菌首先可逆地附著于材料表面，隨后細(xì)菌依靠其菌毛、鞭毛、莢膜及分泌的細(xì)胞外黏質(zhì)物(ESS)形成黏附并不斷繁殖，較多的ESS與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如纖維蛋白原等共同形成生物膜，加速細(xì)菌的黏附，并保護(hù)細(xì)菌免受藥物及免疫攻擊，常規(guī)保守治療無效，導(dǎo)致植入失敗。n-HA/PA66作為新型植骨材料已被成功應(yīng)用于創(chuàng)傷骨科植骨融合中，其具有良好生物相容性、骨傳導(dǎo)性、成骨活性及生物力學(xué)特性。但是脊柱結(jié)核屬感染性病灶，結(jié)核分支桿菌對n-HA/PA66的黏附性是決定其能否應(yīng)用于結(jié)核病灶內(nèi)的首要問題。

本研究通過掃描電鏡觀察，兩種植骨材料表面黏附的結(jié)核分支桿菌數(shù)量很少，僅少量細(xì)菌呈棒桿狀、“Y”、“r”或“L”形，細(xì)菌周邊亦未見明顯黏質(zhì)樣物或明顯保護(hù)膜。因此可見，結(jié)核分支桿菌對兩種材料的黏附能力均較弱，原因可能與材料特性有關(guān)，也可能與結(jié)核分支桿菌無菌毛、鞭毛、莢膜等黏附“配體”，導(dǎo)致此菌活動(dòng)力差有關(guān)。提示鈦金屬及n-HA/PA66人工材料均能安全應(yīng)用于脊柱結(jié)核病灶中進(jìn)行植骨融合。

周勁松等[15]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的黏附與材料的性質(zhì)關(guān)系不大，與材料表面的光滑度有一定關(guān)聯(lián)，呈負(fù)相關(guān)。本研究中掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，n-HA/PA66人工材料表面所黏附菌量明顯較鈦金屬表面多。其機(jī)理可能為：粗糙表面黏附表面積較大，其表面自由能、疏水性的會(huì)發(fā)生變化，表面的溝紋、凹陷部位為細(xì)菌黏附提供了“優(yōu)勢”部位。由此同一材料其表面光滑度是細(xì)菌黏附力的重要影響因素。故出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能與n-HA/PA66人工材料表面光滑度不及鈦金屬有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，盡管結(jié)核分支桿菌對兩類材料黏附性有差異，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析細(xì)菌黏附數(shù)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示n-HA/PA66人工材料可能也可用于脊柱結(jié)核病灶中進(jìn)行植骨融合。由于本研究樣本量小，可能存有誤差，結(jié)果不具有普遍性，加之n-HA/PA66人工材料表面硬度、光滑度不及鈦金屬，故應(yīng)用于臨床治療結(jié)核性骨缺損還應(yīng)慎重。