子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中錯(cuò)配修復(fù)基因的表達(dá)變化及其相關(guān)影響因素

劉彩虹,于淑莉,武文杰

(1承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河北承德 067000；2承德市婦幼保健院)

子宮內(nèi)膜癌是女性最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，以子宮內(nèi)膜樣腺癌最常見(jiàn)，占80%～85%，常伴有子宮內(nèi)膜增生,其中子宮內(nèi)膜不典型增生被認(rèn)為是癌前期病變[1]。子宮內(nèi)膜癌近年來(lái)呈年輕化趨勢(shì)，發(fā)病率逐年上升，其中散發(fā)病例約占90%，有遺傳背景的病例約占10%[2]。錯(cuò)配修復(fù)是細(xì)胞復(fù)制后的一種修復(fù)機(jī)制，起著維持DNA復(fù)制保真度和控制基因突變的作用，錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)缺陷引起的常染色體顯性遺傳病被稱為L(zhǎng)ynch綜合征(LS)，其中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2是最常見(jiàn)發(fā)生突變的四個(gè)MMR基因。LS特征為早發(fā)性結(jié)腸癌，常同時(shí)或異時(shí)伴有其他腸外器官腫瘤，其中子宮內(nèi)膜癌是其最常見(jiàn)的腸外腫瘤[3]。目前MMR表達(dá)和突變檢測(cè)的研究主要集中于結(jié)腸癌，并且在國(guó)際上已被規(guī)范地應(yīng)用于結(jié)直腸癌患者篩查[4]。但在子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜非典型增生中有關(guān)MMR的研究較少，結(jié)果尚無(wú)定論。本研究中我們應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)正常周期子宮內(nèi)膜、非典型增生子宮內(nèi)膜以及子宮內(nèi)膜樣腺癌標(biāo)本中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白的表達(dá)情況，以探討MMR缺陷與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其影響因素。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取承德市婦幼保健院病理科2013年1月～2017年12月存檔的石蠟包埋標(biāo)本，由兩位高年資病理科醫(yī)師復(fù)閱切片明確診斷。嚴(yán)格按照WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，納入研究子宮正常組織和子宮內(nèi)膜樣腺癌標(biāo)本共200例份。其中正常周期子宮內(nèi)膜標(biāo)本50例份(正常組)、非典型增生子宮內(nèi)膜標(biāo)本50例份(增生組)、子宮內(nèi)膜樣腺癌標(biāo)本100例份(腺癌組)。腺癌組中，年齡(53.2±6.8)歲，≤50歲25例，>50歲75例；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)≤24 kg/m2者38例，>24 kg/m2者 62例；月經(jīng)初潮年齡≤13歲77例，>13歲23例；國(guó)際婦產(chǎn)科醫(yī)師聯(lián)盟(FIGO)分期：Ⅰ～Ⅱ期55例，Ⅲ～Ⅳ期45例；合并其他部位惡性腫瘤史7例，未合并93例；肌層浸潤(rùn)深度：≤1/2肌層65例，>1/2肌層35例；腫瘤組織分化程度：高分化37例，中低分化63例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74例。增生組中，年齡(53.9±7.2)歲，≤50歲11例，>50歲39例；正常組中，年齡(52.7±6.2)歲，≤50歲10例，>50歲40例。各組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 MMR的檢測(cè) 采用免疫組化En Vision法。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，鼠單克隆抗體MLH1、MSH2、MSH6和PMS2、免疫組化En Vision試劑盒以及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。具體步驟如下：石蠟標(biāo)本行4 μm厚連續(xù)切片，切片脫蠟、水化，在0.01 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)中進(jìn)行煮沸熱修復(fù)法修復(fù)抗原，以3% H2O2甲醇液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，洗滌后滴加一抗鼠單克隆抗體MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗后滴加二抗，37 ℃孵育40 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判定：MMR蛋白陽(yáng)性表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒[5]。兩位高年資病理科醫(yī)師閱片，選取10個(gè)高倍鏡視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性，>10%為陽(yáng)性。以一種及以上MMR蛋白陰性表達(dá)判定為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)[6]。以發(fā)生MSI的子宮內(nèi)膜樣腺癌判定為L(zhǎng)S相關(guān)子宮內(nèi)膜癌。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MLHl、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達(dá) MLHl、MSH2、MSH6、PMS2蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，為黃色或棕黃色顆粒。見(jiàn)圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜腺樣腺癌患者M(jìn)SI(×200)

注：MLH1蛋白陰性表達(dá)(圖A)；MSH2蛋白陽(yáng)性表達(dá)(圖B)；PMS2蛋白陽(yáng)性表達(dá)(圖C)；MSH6蛋白陽(yáng)性表達(dá)(圖D)。

2.2 各組MLH1、MSH2、PMS2、MSH6陰性表達(dá)率及MSI發(fā)生率比較 三組MLH1和PMS2陰性表達(dá)率比較，腺癌組>增生組>正常組，P均<0.05。各組MSH2和MSH6陰性表達(dá)率比較，P均>0.05。各組MSI發(fā)生率比較，腺癌組>增生組>正常組，P均<0.05。見(jiàn)表1。

表1 各組MLH1、MSH2、PMS2、MSH6陰性表達(dá)率及MSI發(fā)生率比較[例(%)]

2.3 LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌與散發(fā)癌患者臨床病理特征比較 100例子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中，存在MSI 38例(LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌)，不存在MSI 62例(散發(fā)癌)。LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌與散發(fā)癌患者相比，年齡、合并其他部位惡性腫瘤史等差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，浸潤(rùn)深度、月經(jīng)初潮年齡、BMI、FIGO分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌與散發(fā)癌患者臨床病理參數(shù)的比較(例)

3 討論

MMR基因系統(tǒng)是近年在遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌中分離出的控制人體基因變異、維持基因穩(wěn)定的基因系統(tǒng)。MMR基因系統(tǒng)蛋白能夠特異性地識(shí)別并糾正DNA堿基的錯(cuò)誤配對(duì)以及消除插入-缺失環(huán)的形成，在維持遺傳穩(wěn)定性和完整性方面發(fā)揮著重要作用，是人體細(xì)胞的一種安全保障體系。機(jī)體MMR功能異?？梢栽斐杉?xì)胞DNA修復(fù)錯(cuò)誤，導(dǎo)致患者DNA出現(xiàn)MSI，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。MSI已被公認(rèn)為繼癌基因和抑癌基因之后腫瘤研究方面的又一個(gè)重大進(jìn)展[7]。目前MMR基因系統(tǒng)缺陷在結(jié)直腸癌基因研究、患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、分子機(jī)制及腫瘤預(yù)防方面均取得了很大進(jìn)展[8]。子宮內(nèi)膜是人體增生最活躍的組織之一，細(xì)胞中DNA復(fù)制頻繁、堿基錯(cuò)配率較高、MMR基因系統(tǒng)缺失發(fā)生MSI，可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。近年有關(guān)MMR基因系統(tǒng)在子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜不典型增生發(fā)生發(fā)展中作用的研究逐漸引起各國(guó)學(xué)者的注意，但結(jié)果不一致，尚未形成共識(shí)[9]。DNA測(cè)序是檢測(cè)MSI最可靠的方法，但由于檢測(cè)費(fèi)用很高，在無(wú)目標(biāo)人群時(shí)，臨床難以廣泛應(yīng)用。免疫組化檢測(cè)錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失與DNA測(cè)序檢測(cè)結(jié)果之間有很高的吻合度，費(fèi)用較低，易于臨床廣泛開(kāi)展，并且靈敏性和特異性很高[6,10]。本研究中，我們通過(guò)免疫組化法檢測(cè)正常周期子宮內(nèi)膜、非典型增生子宮內(nèi)膜以及子宮內(nèi)膜樣腺癌標(biāo)本中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)腺癌組MSI發(fā)生率高于其他各組，并且增生組MSI發(fā)生率高于正常組，提示MMR基因表達(dá)缺失造成的MSI在子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

迄今為止，已分離出9種MMR基因,其中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2是最常見(jiàn)發(fā)生突變的四個(gè)MMR基因。在DNA復(fù)制過(guò)程中，首先MSH2和MSH6相互結(jié)合形成MutS-α二聚體復(fù)合物結(jié)合到錯(cuò)配修復(fù)區(qū)域，再與MutL-α二聚體復(fù)合物(MLH1和PMS2互相結(jié)合形成)結(jié)合，啟動(dòng)DNA修復(fù)反應(yīng)，切除錯(cuò)配修復(fù)區(qū)域的DNA片段，并重新合成DNA連接。其中任何一個(gè)MMR基因的缺失表達(dá)都將導(dǎo)致MMR系統(tǒng)功能異常，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。近年國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，子宮內(nèi)膜樣腺癌中四個(gè)MMR基因蛋白的表達(dá)缺失率不甚相同。各個(gè)研究報(bào)道缺失率不同的原因可能與種族、地區(qū)、年齡以及樣本數(shù)量差異有關(guān)[11]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜樣腺癌中MLH1、MSH2、PMS2和MSH6陰性表達(dá)率分別為29%、10%、21%、7%，以MLH1和PMS2的陰性表達(dá)為主，與國(guó)內(nèi)外研究[12～15]基本一致。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)腺癌組、增生組與正常組MLH1和PMS2陰性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但各組MSH2和MSH6陰性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MLH1和PMS2的陰性表達(dá)在子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著更重要的作用。

Walsh等[16]在研究中通過(guò)免疫組化法檢測(cè)4種MMR蛋白，發(fā)現(xiàn)至少有1種蛋白缺失在年齡<50歲的子宮內(nèi)膜癌患者中比例較高。Wang等[17]報(bào)道，LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌的顯著特點(diǎn)是發(fā)病年齡早，對(duì)比發(fā)現(xiàn)LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌患者年齡低于散發(fā)癌患者。為了進(jìn)一步明確LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌的臨床發(fā)病特點(diǎn)及MSI發(fā)生的相關(guān)影響因素，我們進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌患者與散發(fā)癌患者相比，在年齡、合并其他部位惡性腫瘤史等方面差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌在低齡及合并其他部位惡性腫瘤史的患者中更常見(jiàn)，而兩組患者在月經(jīng)初潮年齡、BMI、FIGO分期、分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MSI發(fā)生與低齡及合并其他部位惡性腫瘤有關(guān)。在臨床工作中，對(duì)于低齡、合并有其他部位惡性腫瘤的子宮內(nèi)膜樣腺癌患者應(yīng)注意篩選LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌，對(duì)可疑LS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌應(yīng)該加強(qiáng)隨訪，預(yù)防異位癌的發(fā)生，早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療。

綜上所述，子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生過(guò)程中，MLH1、PMS2蛋白缺失，可導(dǎo)致MSI；MSI的發(fā)生與低齡及合并其他部位惡性腫瘤史有關(guān)。