泡球蚴感染小鼠肝M2型巨噬細(xì)胞的變化

李斌，王亮，劉玉梅，楊寧，閆怡,，姜濤，高劍，丁劍冰，馬秀敏,阿曼古麗·牙生

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院·省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室，烏魯木齊830011；2新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

泡型包蟲病是由多房棘球絳蟲的幼蟲泡球蚴作為主要病原體的一種致死率高、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。泡型包蟲病多始發(fā)于肝臟，泡球蚴在肝臟寄生后，從母泡囊會不斷增殖出新的子泡囊，因其出芽式的生長方式與惡性腫瘤相似，故又有“蟲癌”一稱。巨噬細(xì)胞作為多種免疫細(xì)胞中重要的一員，有多種功能，可以在特異性免疫和非特異性免疫中同時發(fā)揮不同作用。有學(xué)者將巨噬細(xì)胞大致分為M1和M2兩種極化類型，M1型巨噬細(xì)胞主要參與Th1型免疫反應(yīng)，是通常理解的發(fā)揮正向作用的功能細(xì)胞；M2型巨噬細(xì)胞則主要參與Th2型免疫反應(yīng)和體液免疫，其可以使細(xì)胞內(nèi)的病原體受到相對較弱的殺傷力，同時加強(qiáng)清除機(jī)體殘留物質(zhì)的能力[1]。研究表明，在某些疾病的發(fā)展進(jìn)程中，病原體會為了躲避巨噬細(xì)胞的噬菌作用從而迫使其從M1型向M2型發(fā)展，從而進(jìn)一步加快疾病的發(fā)展進(jìn)程[2]。2017年7月～2018年5月，本研究通過檢測泡球蚴感染小鼠肝臟中M2型巨噬細(xì)胞的動態(tài)改變，探討其在泡球蚴感染小鼠肝臟中的可能免疫機(jī)制，為泡球蚴感染的基礎(chǔ)和臨床研究提供初步實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物: 雌性BALB/c小鼠48只，保種BALB/c小鼠1只,6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。主要試劑和儀器:CD163多克隆兔抗鼠抗體購自北京博奧森公司。磷酸鹽緩沖液粉末、枸櫞酸鹽緩沖液粉末、生物素標(biāo)記的通用型二抗試劑盒購自北京中衫生物技術(shù)有限公司。PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 動物模型建立及分組 將感染泡球蚴的保種BALB/c小鼠處死，取出感染組織，分離出壞死組織，用5 mL注射器將嚢液吸出，剩余組織剪碎、研磨、200目尼龍網(wǎng)過篩，使用含青鏈雙抗的生理鹽水反復(fù)沖洗沉淀3次，最后1次沉淀后用PBS重懸，用0.5%伊紅染料計數(shù)原頭節(jié)的著色率及形態(tài)，確保原頭節(jié)的存活率>90%后，準(zhǔn)備腹腔注射。將48只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組，模型組各24只。模型組小鼠每只腹腔注射2 000個原頭節(jié)，對照組小鼠每只注射等體積的生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集 分別于接種后90、180、300 d頸椎脫臼法處死8只對照組小鼠和對應(yīng)模型組的全部小鼠，打開腹腔，暴露肝臟，無菌剝?nèi)⌒∈蟮母闻K，一部分置于10%的中性甲醛溶液中，固定24 h以上，后用于HE染色和免疫組織化學(xué)檢測。另一部分經(jīng)液氮快速冷凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱，后用于提取總RNA，待實時熒光定量PCR檢測。

1.4 組織標(biāo)本HE染色 將固定好的組織進(jìn)行組織脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后進(jìn)行常規(guī)HE染色、封片，顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.5 肝臟組織CD163蛋白表達(dá)水平的檢測 采用免疫組化法。制片方法同HE染色，將制得的片子常規(guī)脫蠟至水后，使用3%過氧化氫室溫孵育10 min，枸櫞酸鹽緩沖液95 ℃微波修復(fù)15 min，冷卻至室溫，滴加山羊血清工作液37 ℃封閉30 min，滴加一抗，4 ℃孵育過夜，室溫放置1 h后滴加生物素標(biāo)記的通用型二抗室溫孵育2 h，DAB室溫顯色，蘇木素復(fù)染后快速脫水封片。其中陰性對照的一抗使用PBS代替。鏡下觀察，每張肝組織免疫組化切片在400倍光鏡下隨機(jī)選取5個不同視野分別采集圖像，將陽性表達(dá)和陰性表達(dá)所占的面積使用Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計，再算出陽性面積百分比和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.6 肝臟組織Fizzl mRNA表達(dá)水平的檢測 采用實時熒光定量PCR法。從-80 ℃冰箱分別取對照組、模型組接種90、180、300 d約100 mg肝組織，采用TRIzol法抽提總RNA，測定OD260/280值并記錄濃度，OD260/280值在1.8～2.1。將所有標(biāo)本總RNA濃度調(diào)整到500 ng/μL，各取總RNA 1 μL使用PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，將制成的cDNA標(biāo)本分別取2 μL加入PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒中的qPCR體系，于實時熒光定量PCR儀上檢測Fizz1、GAPDH的表達(dá)量。實時熒光定量PCR中所用的引物由上海生工公司合成，其上游引物序列：5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，下游引物序列：5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′；Fizz1基因作為目的基因，其上游引物序列：5′-TCCAGCTAACTATCCCTCCACTGT-3′，下游引物序列：5′-GGCCCATCTGTTCATAGTCTTGA-3′。選擇小鼠GAPDH基因作為內(nèi)參。記錄反應(yīng)后各組Ct值，采用2-ΔΔCt相對定量法對各目標(biāo)基因進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.1 各組大體觀察結(jié)果 肉眼所見：對照組小鼠解剖后未見肝臟和腹腔存在異常變化，肝臟質(zhì)地柔軟、光滑，色澤紅潤，無明顯粘連，肝臟解剖位置正常。模型組接種90 d解剖后發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔內(nèi)彌散許多囊泡，大小不等，多為小囊泡融合而成。與對照組相比，肝臟質(zhì)地稍硬，體積稍增大，色澤較暗淡，與周圍組織和胸腔存在部分粘連，解剖位置已偏離正常位置。接種180 d解剖后發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔中存在大量囊泡，部分體積較大，囊泡中存在壞死、鈣化，與被侵蝕的組織分界較模糊。被囊泡侵蝕的肝臟顏色暗淡，部分已經(jīng)變黃、變白，質(zhì)地偏硬，體積較對照組有所縮小，與胸腔和周圍臟器粘連明顯且不易分離，已明顯偏離正常解剖位置。接種300 d解剖后發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)粘連嚴(yán)重，囊泡體積巨大，被囊泡侵蝕的肝臟已不能完整分離，其部分顏色暗淡，質(zhì)地較硬，已完全脫離正常解剖位置。鏡下觀察：對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞邊界清晰，排列整齊，可見肝細(xì)胞質(zhì)疏松化，偶見炎性細(xì)胞聚集。模型組接種90 d肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，可見炎性細(xì)胞浸潤加重，部分膽管增生，可見囊泡的囊壁形成，囊壁內(nèi)側(cè)偶見頭節(jié)。接種180 d，正常肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝細(xì)胞壞死明顯，出現(xiàn)空泡樣變性，大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生明顯。接種300 d，部分肝小葉結(jié)構(gòu)已不可見，空泡樣變性明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維結(jié)締組織繼續(xù)增生。

2.2 不同時期小鼠肝臟組織CD163表達(dá)比較 在感染后不同時間段，對照組小鼠肝臟中很少或者基本不表達(dá)CD163。相比于對照組， 90 d時模型組肝臟組織中CD163的表達(dá)升高(P<0.05)；180 d時CD163的表達(dá)水平達(dá)到峰值(P<0.01)；300 d時CD163的表達(dá)呈現(xiàn)出下降趨勢，但仍比對照組高(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 不同時期小鼠肝臟組織CD163的免疫組化結(jié)果(×400)

注：A：對照組；B、C、D：模型組接種90 d、180 d、300 d。

表1 兩組不同時期小鼠肝臟組織CD163蛋白表達(dá)比較

2.3 兩組不同時期肝臟組織Fizz1 mRNA表達(dá)比較 對照組肝臟組織中Fizz1 mRNA相對表達(dá)量在90、180、300 d基本穩(wěn)定。與同期對照組相比，90 d，模型組肝臟中Fizz1 mRNA的相對表達(dá)量增加(P=0.004)；180 d，模型組Fizz1 mRNA的相對表達(dá)量達(dá)到峰值(P=0.000)；而300 d，模型組Fizz1 mRNA的相對表達(dá)量有所下降，但差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)(見圖2、表2)。

圖2 兩組不同時期肝臟組織Fizz1 mRNA的表達(dá)比較

表2 各組小鼠肝臟中Fizz1 mRNA的相對表達(dá)量比較

3 討論

寄生蟲病在人類傳染病中占有十分重要的地位，泡型包蟲病是一種流行在畜牧地區(qū)的人畜共患寄生蟲病，具有潛伏期長、病死率高等特點。人因誤食多房棘球絳蟲的蟲卵成為中間宿主而患病，并且患者的原發(fā)病灶多為肝臟。巨噬細(xì)胞是固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要組成部分，在感染性疾病中發(fā)揮了重要作用。本實驗以泡球蚴感染的小鼠為模型，檢測了感染中、后期小鼠肝臟組織中M2型巨噬細(xì)胞的動態(tài)變化，試說明其與泡球蚴感染中晚期的關(guān)系。

肝臟中巨噬細(xì)胞占非實質(zhì)細(xì)胞的35%[3]，在調(diào)節(jié)生理機(jī)能、維持各項功能的動態(tài)平衡、炎癥反應(yīng)中是不可或缺的一部分。特異性和可塑性是巨噬細(xì)胞的特點，在不同微環(huán)境和細(xì)胞因子的綜合影響下，巨噬細(xì)胞可以極化成不同類型，即經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型具有釋放促炎因子、調(diào)節(jié)Th1型免疫、抗原的提呈等功能；而M2型則表現(xiàn)出“抑炎”功能，可以促進(jìn)血管生成和組織修復(fù)。IL-4、IL-10、IL-13等均可刺激巨噬細(xì)胞實現(xiàn)M2型極化，STAT6信號通路在被IL-4/IL-13激活后可以增加M2型極化所必需的相關(guān)基因表達(dá)，如Mrc1、Ym1、Fizz1。CD163作為M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記之一，起調(diào)節(jié)人體免疫的作用。它可識別腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)因子，并與其特異性結(jié)合，發(fā)揮抗炎作用，對部分病原體進(jìn)行實時監(jiān)測；在炎性反應(yīng)刺激下，CD163與其配體相結(jié)合后，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使單核細(xì)胞與上皮細(xì)胞黏附，誘導(dǎo)IL-10等炎性因子釋放。但不能簡單地將CD163的功能概括成抗炎作用，它在免疫調(diào)節(jié)中的作用十分復(fù)雜，具體機(jī)制還有待更深入研究[4～6]。研究表明，在血吸蟲感染過程中，肝臟的早期免疫反應(yīng)類型以Th1型為主，隨著感染的進(jìn)行，逐漸向Th2型轉(zhuǎn)變，巨噬細(xì)胞的極化類型也從M1型轉(zhuǎn)化成M2型[7]。

Wynn等[8]研究表明，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生M2型巨噬細(xì)胞極化，抑制M1型巨噬細(xì)胞促炎因子的釋放，可抑制肝臟纖維化進(jìn)程。Abdallahi等[9]認(rèn)為，M2型巨噬細(xì)胞極化抑制Th1細(xì)胞分泌的促炎因子釋放，會有利于蠕蟲的生長。Blériot等[10]研究表明，IL-4能誘導(dǎo)單核來源的巨噬細(xì)胞從M1型轉(zhuǎn)化為M2型，同時可作用于尚存的巨噬細(xì)胞，使其局部增殖并分化為M2型巨噬細(xì)胞，后者通過分泌IL-10，活化精氨酸酶，進(jìn)而刺激單核細(xì)胞來源的M1型巨噬細(xì)胞的凋亡[11～14]。M2型巨噬細(xì)胞能通過分泌大量抗炎因子，如TGF-β、IL-10等，削弱炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)免疫耐受，如在小鼠細(xì)粒棘球蚴感染后期，體內(nèi)IL-10持續(xù)高表達(dá)[15]。

本實驗通過免疫組化以及qRT-PCR法檢測了泡球蚴感染中后期小鼠肝臟內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志和基因表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組在感染90 d后，M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志和基因的表達(dá)都升高；隨后在感染180 d后，表達(dá)量到達(dá)了峰值；在感染300 d后，它們的表達(dá)量都開始出現(xiàn)下降趨勢，卻依然保持在較高水平。表明在感染中后期，為了避免大量炎性細(xì)胞繼續(xù)加重組織的損傷，機(jī)體啟動了保護(hù)機(jī)制促使M2型巨噬細(xì)胞增殖，促進(jìn)損傷的組織進(jìn)行修復(fù)，抑制炎性細(xì)胞過強(qiáng)的作用；但同時也降低了其對病原體的殺傷能力，這也可能是導(dǎo)致泡球蚴逃避機(jī)體免疫功能的一個原因。

綜上所述，巨噬細(xì)胞在寄生蟲病中有著重要的免疫調(diào)節(jié)功能，因此我們在疾病進(jìn)展的不同時期調(diào)控不同極化類型的巨噬細(xì)胞數(shù)量和比例，使其達(dá)到一個理想的狀態(tài)，從而使疾病在一定程度上得到控制，這可以為疾病的研究和治療提供一個新思路。本研究揭示了在泡球蚴感染中后期M2型巨噬細(xì)胞的變化，為下一步研究M2型巨噬細(xì)胞在泡型包蟲病中的調(diào)控機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。