SHh、Ptch1蛋白表達水平變化與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性分析

張志勇

(許昌市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 許昌 461000)

胰腺癌的發(fā)生能夠?qū)е禄颊卟∷缆实娘@著上升，胰腺癌的早期診斷水平較低，疾病的病情進展較為陰離子。流行病學(xué)研究顯示，胰腺癌的發(fā)病率可達344～566/10萬人左右[1]，且近年來在部位合并有膽道系統(tǒng)疾病的人群中，胰腺癌的發(fā)病率更高[2]。

分子生物學(xué)因子的改變，能夠通過影響到惡性腫瘤早期發(fā)生過程中的細胞生物學(xué)特征，干預(yù)到癌細胞的增殖、凋亡及分化等病理過程。hedgehog信號通路能夠通過激活癌細胞的轉(zhuǎn)錄，提高癌細胞的異常增殖的風(fēng)險，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。Hh配體蛋白（SHh）、Hh 受體蛋白（Ptch1）均為 hedgehog信號通路上主要的核心效應(yīng)蛋白，其主要表達中胚層組織、新生兒心肌細胞組織及部位平滑肌細胞組織中，近年來相關(guān)基礎(chǔ)方面的研究顯示，SHh、Ptch1蛋白能夠促進胰腺上皮細胞或者腺體細胞的持續(xù)性DNA核的異常分裂，增加癌細胞的侵襲或者轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，同時SHh、Ptch1蛋白還能夠在促進腫瘤病灶新生血管的形成，增加腫瘤病灶的血流灌注等方面發(fā)揮作用，促進病情的進展[3，4]。 為了進一步探討 SHh、Ptch1 蛋白等在促進胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，從而為臨床上胰腺癌的血清學(xué)篩查提供依據(jù)，本次研究選取我院確診的胰腺癌患者組織標(biāo)本100例，探討了相關(guān)指標(biāo)的蛋白水平表達及其與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，報告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選河南省許昌市人民醫(yī)院2014年10月－2017年2月手術(shù)后胰腺癌組織標(biāo)本100例（病灶組）、癌旁組織50例（癌旁組）。病灶組，年齡38～70 歲，平均年齡 53．41±12．57 歲，男性 49 例，女性51例；TNM分期Ⅰ期33例，Ⅱ期36例，Ⅲ期31例；分化程度：高分化38例，中低分化62例；無淋巴轉(zhuǎn)移44例，有淋巴轉(zhuǎn)移56例；對照組，年齡36～71 歲，平均年齡 52．46±13．15 歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

1．2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1．2．1 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴術(shù)前未合并其他部位惡性腫瘤；⑵術(shù)后病理證實為胰腺癌；⑶手術(shù)根治性切除腫瘤，術(shù)后生存期大于1個月，未發(fā)生圍術(shù)期并發(fā)癥；⑷有完整規(guī)范的術(shù)后病理報告及隨訪資料；⑸術(shù)前未接受介入治療、放化療；⑹無高血壓、糖尿病、腎炎、急慢性盆腔炎及子宮內(nèi)膜異位癥等疾病，近期均未服影響前列腺素和血栓素代謝的藥物。

1．2．2 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；⑵未能完成隨訪者；⑶貧血及凝血功能障礙；⑷風(fēng)濕及免疫系統(tǒng)疾病；⑸嚴(yán)重的肝腎功能疾病；⑹甲狀腺功能障礙；⑺因其他部位腫瘤進行過放化療治療者。

1．3 免疫組化染色 所有組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后作連續(xù)切片，厚度約為4mm，采用免疫組化鏈霉卵白素一生物素復(fù)合體法 (strep avidin－biotin complex，SABC法)染色，二氨基聯(lián)苯胺(diamionben zidene，DAB)顯色。 SHh、Ptch1 蛋白抗體、PV6000 通用型二抗以及SP試劑盒和DAB顯色盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司。以陽性片及PBS代替一抗分別作為陽性及陰性對照，高倍顯微鏡下觀察SHh、Ptch1蛋白的表達情況，具體染色步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進行操作。

1．4 免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化結(jié)果判定：以在呈現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒為陽性，按陽性細胞所占比例數(shù)分為： 染色強度分為－(陰性)、+(弱)、++(中度)、+++(強)； 染色范圍為－(0%～5%)、+(6%～25%)，++(26%～50%)、+++(＞50%)。 兩種蛋白陽性表達結(jié)果中，(一)歸為陰性表達組，(+)、(++)、(+++)歸為陽性表達組。

1．5 蛋白檢測方法及結(jié)果分析 Western blot檢測蛋白的相對表達量：冰上分離出組織，置于預(yù)冷的研缽中液氮研磨至粉末狀。按4：l（緩沖液：樣品蛋白）的比例加上樣緩沖液，每條泳道加20ul緩沖液稀釋的樣品，于60V電壓下跑膠，脫脂蛋白封閉2h， 羊抗 SHh、Ptch1 蛋白抗體 （濃度 1：1000），2h后加入二抗（濃度 1：200）。 Image pro plus 4．01 版本的專業(yè)圖像分析軟件 （購自上海精密儀器有限公司）進行圖像分析，SHh、Ptch1蛋白抗體購自羅氏檢測公司。

Western Blot結(jié)果分析：把各自的灰度值都用內(nèi)參校正，得到蛋白的相對含量。

1．6 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計軟件采用SPSS 17．0，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進行統(tǒng)計描述，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；P值＜0．05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組組織標(biāo)本中SHh、Ptch1蛋白的表達情況比較 病灶組、對照組的SHh蛋白表達陽性率分別為 68．00%、10．00%（P＜0．001）。 病灶組、 對照組的Ptch1 蛋白表達陽性率分別為 65．00%、6．00%（P＜0．001），見表 1、表 2。

表1 組織標(biāo)本中SHh蛋白表達情況比較

表2 組織標(biāo)本中Ptch1蛋白表達情況比較

2．2 兩組組織標(biāo) SHh、Ptch1蛋白印跡檢測結(jié)果病灶組SHh、Ptch1蛋白量與癌旁組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），見表 3。

表3 SHh、Ptch1蛋白表達水平比較

2．3 胰腺癌組織標(biāo)本中的SHh、Ptch1蛋白表達與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 中低分化胰腺癌組織Shh、Ptch1蛋白平均表達率高于高分化胰腺癌組織Shh、Ptch1蛋白率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；SHh、Ptch1 蛋白表達與患者年齡、性別、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0．05），見表 4。

3 討論

胰腺癌的發(fā)病病因較為復(fù)雜，一般認為基因水平或者膽道系統(tǒng)基礎(chǔ)性疾病可能是促進胰腺癌發(fā)生的主要因素[5，6]。近年來，越來越多的研究顯示，基因調(diào)控或者分子生物學(xué)水平的改變，是促進胰腺癌發(fā)生的又一重要因素。分子譜相關(guān)水平的波動，能夠在影響到癌細胞的生物學(xué)特征、增強癌細胞細胞周期的調(diào)控，促進免疫逃逸、抑制機體的T淋巴細胞免疫反應(yīng)等，進而協(xié)助腫瘤的浸潤或者轉(zhuǎn)移[7，8]。本次研究通過對于 Shh、Ptch1蛋白等生物學(xué)因子與胰腺癌發(fā)病的關(guān)系研究，特別是對于Shh、Ptch1蛋白與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系研究，能夠為臨床上胰腺癌的早期高危篩查提供潛在的分子參考。

SHh、Ptch1蛋白能夠增強胰腺腺體上皮細胞基因錯配的幾率，誘導(dǎo)癌基因的點突變的發(fā)生風(fēng)險。SHh與其配體結(jié)合后，能夠誘導(dǎo)低氧環(huán)境，增加癌細胞的持續(xù)性DNA分裂的風(fēng)險。SHh蛋白結(jié)構(gòu)上包含的多個可結(jié)合的巰基結(jié)構(gòu)，能夠促進患者體內(nèi)的癌細胞膜表面的糖蛋白的激活，增加癌細胞內(nèi)的腫瘤相關(guān)信號通路如AKT等的上調(diào)，增加癌細胞分化凋亡障礙[9，10]。Ptch1蛋白作為受體水平的糖蛋白分子，其與相關(guān)配體結(jié)合后，能夠增加胰腺細胞內(nèi)的腫瘤易感分子的攜帶風(fēng)險，導(dǎo)致癌細胞的早期T淋巴細胞的免疫逃逸，影響到機體的免疫監(jiān)察作用[11，12]。部分研究揭示了hedgehog信號通路相關(guān)信號效應(yīng)分子對于消化道系統(tǒng)惡性腫瘤或者生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生的影響作用，認為SHh、Ptch1蛋白能夠顯著促進癌細胞對于臨近正常組織的浸潤及擴散的風(fēng)險。

表4 胰腺癌組織Shh、Ptch1蛋白表達與臨床病理因素的關(guān)系

本研究通過免疫組化分析研究及蛋白定量水平的相關(guān)表達分析發(fā)現(xiàn)，SHh、Ptch1蛋白的表達陽性率或者表達濃度均明顯高于胰腺良性病變組或者對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示SHh、Ptch1蛋白能夠在促進胰腺癌發(fā)生過程中發(fā)揮一定的作用，SHh、Ptch1蛋白在胰腺組織中的異常表達能夠通過影響到下列幾個方面的因素，導(dǎo)致胰腺腺體上皮細胞異型性及細胞核異常病變的發(fā)生[13，14]：⑴SHh蛋白對于胰腺腺體上皮細胞粘附能力的改變，不僅能夠促進粘附分子adherin 1的表達上升，同時能夠促進胰腺細胞間質(zhì)成分的分解，為胰腺癌的早期臟器內(nèi)部的轉(zhuǎn)移提供依據(jù)；⑵Ptch1蛋白通過對于AKT或者MAPK等信號通路的激活作用，能夠降低血管內(nèi)皮鈣粘素的表達，提高癌細胞通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換進行轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。趙一鳴等[15]研究者在分析了83例樣本量的胰腺癌患者的癌基因相關(guān)分子譜后發(fā)現(xiàn)，Ptch1蛋白或者其他hedgehog信號通路效應(yīng)蛋白的表達濃度改變，是促進患者治療預(yù)后惡化、治療后的復(fù)發(fā)率的上升等結(jié)局發(fā)生的重要因素。部分研究者認為hedgehog信號通路相關(guān)效應(yīng)分子的表達與胰腺癌患者的淋巴結(jié)浸潤或者臨床分期等主要臨床病理特征密切相關(guān)，但本次研究并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)結(jié)論，考慮可能與樣本量的正態(tài)分布偏移有關(guān)，但也不排除與SHh、Ptch1蛋白等的表達確實難以影響到癌細胞對于淋巴結(jié)內(nèi)皮組織的粘附等過程。在中低分化胰腺癌組織中，相關(guān)蛋白的表達陽性率較高，提示相關(guān)蛋白的異常表達與胰腺癌細胞的細胞分化障礙具有密切的關(guān)系，這可能與SHh、Ptch1蛋白等對于癌細胞分化誘導(dǎo)cyc－m的調(diào)控作用有關(guān)。

綜上所述，SHh、Ptch1蛋白在胰腺癌組織中高表達，并且與胰腺癌的細胞分化程度具有密切的關(guān)系。