紫背天葵揮發(fā)油對羅非魚無乳鏈球菌的抑制活性研究

楊小霞 巫培豪 謝俊剛 曹中 林曼玉 陳冰如 覃亮

(1. 肇慶市水產技術推廣中心，廣東肇慶 526061；2. 肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東肇慶 526061)

羅非魚(Tilapia)又名非洲鯽魚、福壽魚、金鳳魚，原產于非洲東部等地，具有肉質鮮美、平價易得、營養(yǎng)價值高的優(yōu)點，一直深受我國消費者喜愛。肇慶素有“中國羅非魚之鄉(xiāng)”的美譽，近十幾年來羅非魚及其相關產業(yè)鏈逐漸成為肇慶市主導的品種之一。但近年來頻頻爆發(fā)的無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)感染，導致近三年來肇慶市以“吉富”系列羅非魚為主感染無乳鏈球菌后發(fā)病面積超過4000hm2，累計經濟損失超過5000萬元，且情況不斷加劇難以控制，成為該市羅非魚產業(yè)亟須解決的重大隱患之一[1]。

紫背天葵(Begoniafimbristipula)，秋海棠科，秋海棠屬。中國醫(yī)學認為紫背天葵味甘，微酸，性涼，具清熱解毒、潤肺止咳、散瘀消腫、生津止渴之功效，治外感高熱、中暑發(fā)燒、肺熱咳嗽、傷風聲嘶、癰腫瘡毒、跌打腫痛等癥。研究表明，紫背天葵可提高抗寄生蟲和抗病毒的能力，對腫瘤有一定防效[2，3]。紫背天葵屬于藥食同源植物，既可入藥，又是一種很好的營養(yǎng)保健品。本文對紫背天葵中的揮發(fā)油進行提取，并研究了其對羅非魚無乳鏈球菌的抑制活性，以期對肇慶地區(qū)羅非魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

新鮮紫背天葵采自市場，經烘干后供實驗使用；無乳鏈球菌由肇慶市水產技術推廣中心從患病羅非魚腦部解剖分離純化而來；腦心浸液(BHI)液體培養(yǎng)基。

ESJ120-4電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；DHG-9070B干燥箱，上海浦東榮豐科學儀器有限公司；FY135粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；800型離心機，深圳市沙頭角國華儀器廠；GCMS-QP2010氣相色譜質譜連用儀，日本島津公司；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科協儀器有限公司；YX280A手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器機有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫背天葵揮發(fā)油的提取

稱取一定量已剪碎的藥材，裝入揮發(fā)油提取器中，加水浸泡過夜，水蒸氣法蒸餾4h，得黃色透明具有濃烈香味的油狀液體，收集揮發(fā)油。

1.2.2 紫背天葵揮發(fā)油GC-MS分析條件

GC條件：RTX-5MS石英毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，升溫程序：從60℃開始，以7℃/min升溫至200℃，最后以2℃/min升溫至280℃；載氣為He；載氣流量：3.0mL/min；分流比30∶1，進樣量1μL。

MS條件：質譜的電離方式為EI，燈絲電流0.5mA；電子能量70eV，倍增器電壓1.0kV，離子源230℃，掃描周期0.3s，溶劑延遲2.50min。標準譜庫為美國NIST譜庫。

定性分析：取1.0μL揮發(fā)油，用氣相色譜-質譜-計算機聯用儀進行分析鑒定。通過NIST譜庫自動檢索獲得初步鑒定結果。根據所得質譜圖，結合相關文獻進行人工譜圖解析，以確認揮發(fā)油中各化學成分。

1.2.3 紫背天葵揮發(fā)油抑菌測定

取紫背天葵揮發(fā)油、頭孢氨芐溶液、無菌水2mL于燒杯中，分別放入若干直徑為6mm的無菌濾紙密封與浸泡過夜。

取出無乳鏈球菌菌懸液、BHI固體培養(yǎng)基，吸取10mL無乳鏈球菌菌液于離心管中以8000r/min轉速離心1min，再用10mL無菌水重懸細菌，充分振蕩搖勻，吸取200μL菌懸液于BHI固體培養(yǎng)基中涂布均勻，用鑷子分別取出含藥濾紙片吹干后貼于含菌的平板上，每個樣品進行3組重復濃度。

以上操作均在無菌條件下進行，所應用的實驗儀器均經高壓滅菌處理，操作完成后將菌株置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18～24h后觀察結果，用游標卡尺量取抑菌圈大小，記錄數據取平均值。

1.2.4 測定最低抑菌濃度(MIC)

紫背天葵揮發(fā)油用二倍稀釋法用丙酮稀釋成濃度為100%、80%、60%、40%、20%、10%的藥液。取若干直徑為6mm的無菌濾紙分別浸泡于不同稀釋濃度的紫背天葵揮發(fā)油中，在無菌的條件下操作，分別吸取200μL菌液于BHI固體培養(yǎng)基中涂布均勻，每個平板貼上不同藥液濃度的紫背天葵揮發(fā)油藥片，每個平板貼上浸過丙酮的藥片作陰性對比，每個濃度平衡3組。操作完成后將菌株置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18～24h后觀察結果，用游標卡尺量取抑菌圈大小，記錄數據取平均值，以抑菌圈≥6mm的最低稀釋濃度為最低抑菌濃度[4，5]。

2 實驗結果

2.1 紫背天葵揮發(fā)油組分分析

用毛細管氣相色譜法從紫背天葵揮發(fā)油中共分離出51個峰(見圖1)，利用NIST’05系統(tǒng)譜庫自動檢索被分析組分的質譜，結合人工譜圖檢索鑒定各峰的化學組成，用峰面積歸一化法測定出各化學成分的相對含量。根據所得質譜圖，解析得到揮發(fā)油中的39種化學成分。

圖1 紫背天葵揮發(fā)油總離子流圖

已鑒定的成分占揮發(fā)油總量的97.16%，主要為萜烯類及其含氧衍生物，另外還含有酯、醇、醛、烷烴和酸酐等化合物。含量最高的是2-乙氧基丙烷，相對含量為50.51%；含量較高的是次亞麻油酸甲酯，相對含量為11.41%；其次是棕櫚酸甲酯，相對含量為7.47%；正棕櫚酸，相對含量為6.59%；三烯十八碳醇，相對含量為6.29%。本實驗鑒定出來的成分大部分為酯類、酸類、醇類以及酮類化合物，酸類以不飽和酸居多。

2.2 紫背天葵揮發(fā)油抑菌活性研究

紫背天葵揮發(fā)油對無乳鏈球菌的抑菌效果見表1。實驗結果表明，紫背天葵揮發(fā)油對無乳鏈球菌具有較好的抑制效果，對無乳鏈球菌的最低抑菌濃度為12.5%。

表1 紫背天葵揮發(fā)油對無乳鏈球菌的抑菌效果

3 結論

本文以紫背天葵為研究對象，對其揮發(fā)油成分進行了分析，并進一步研究了紫背天葵揮發(fā)油對羅非魚無乳鏈球菌抑菌效果。實驗結果表明，紫背天葵揮發(fā)油對無乳鏈球菌具有明顯抑制效果，最低抑菌濃度為12.5%。由于該揮發(fā)油為混合物，所以對羅非魚無乳鏈球菌起抑制的主要成分還需要進一步的分離研究。本實驗采用的揮發(fā)油提取方法操作簡單，將有助于解決肇慶市乃至全國各地羅非魚感染無乳鏈球菌患病的幾率，使得紫背天葵的市場應用價值得到進一步的提高。