尋常型銀屑病皮損中IL-17和TNF-α的表達

王 娟,鮑海平*

(山西大同大學醫(yī)學院,山西大同037009)

銀屑?。╬soriasis）是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，其病理特征包括表皮角質(zhì)形成細胞異常增殖，真皮淋巴細胞浸潤和血管增生性改變。IL-17是活化CD4+輔助性17（Th17）細胞分泌的特征性細胞因子，在促炎癥反應(yīng)、促血管生成和介導(dǎo)免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要作用。TNF-α參與多種自身免疫和炎癥性疾病，與淋巴細胞的分化、激活、趨化等行為有關(guān)。為探討銀屑病發(fā)病中IL-17和TNF-α的表達情況及其與表皮角質(zhì)形成細胞和淋巴細胞的關(guān)系，我們應(yīng)用免疫組化法檢測尋常型銀屑病皮損中IL-17和TNF-α的表達情況。

1 材料和方法

1.1 材料

收集大同大學附屬醫(yī)院皮膚科尋常型銀屑病患者皮損標本20例，男12例，女8例，年齡34～67歲，平均39.7歲，均經(jīng)臨床和病理檢查確診，同時6月內(nèi)局部或全身未使用過皮質(zhì)類固醇激素和免疫抑制劑類藥物；對照組20例正常皮膚組織，均取自整形科正常皮膚，男11例，女9例，年齡24～65歲，平均37.5歲。2組的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義。所有組織均經(jīng)甲醛固定石蠟包埋后備用。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

兔抗人多克隆IL-17抗體、兔抗人多克隆TNF-α抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，即用型二步法檢測試劑盒PV-9000、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

免疫組化法PV-9000檢測IL-17和TNF-α的表達步驟如下：石蠟標本連續(xù)切片，脫蠟和水化；滴加3%H2O2溶液孵育20 min消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；枸櫞酸鈉緩沖液進行熱修復(fù)；分別滴加IL-17多抗和TNF-α多抗（稀釋濃度均為1∶200），以PBS代替一抗作為陰性對照，再滴加即用型二步法試劑PV-9000。上述步驟均用PBS沖洗5 min×3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水封片。

1.4 結(jié)果判定

參照IL-17和TNF-α試劑說明，以細胞漿染色呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，不著色為陰性細胞。采用MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)分析標本染色情況，利用積分光密度值(integrated optical density，IOD)代表每張標本的表達強度。每張標本切片隨機測定5個高倍視野（×400）的IOD值，取平均值為最終結(jié)果，用±s表示。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 IL-17表達結(jié)果

IL-17在尋常型銀屑病皮損中陽性表達于表皮基底層、棘層，真皮淋巴細胞也有部分表達，而在正常皮膚組織中，僅少量表達于表皮基底層，經(jīng)統(tǒng)計學比較，尋常型銀屑病組IL-17的表達水平明顯高于正常皮膚組(P＜0.01)。見表1。

2.2 TNF-α表達結(jié)果

TNF-α在尋常型銀屑病組織中陽性細胞廣泛分布于表皮各層，呈簇集性連續(xù)表達，在真皮淋巴細胞浸潤帶也有表達，而在正常皮膚組織中表達陰性或弱陽性，經(jīng)統(tǒng)計學比較，尋常型銀屑病組TNF-α表達水平明顯高于正常皮膚組(P＜0.01)。見表1。

2.3 相關(guān)性分析

尋常型銀屑病組中IL-17和TNF-α的表達水平呈正相關(guān)，r為0.53，（P＜0.01）。

表1 2組間IL-17和TNF-α的IOD均數(shù)值比較

3 討論

銀屑病的組織病理改變主要包括表皮增厚、真皮淋巴細胞為主的炎性浸潤和血管的異常增殖。近年研究發(fā)現(xiàn)由T細胞介導(dǎo)的免疫機制在銀屑病發(fā)生中具有重要作用，Th17細胞是T細胞的重要亞群，由其產(chǎn)生的細胞因子參與了銀屑病的發(fā)生[1-2]。IL-17是Th17細胞分泌的最重要的前炎癥細胞因子，是含有一個N-末端信號肽的155個氨基酸組成的糖蛋白，通過與靶細胞上特異性受體IL-17R結(jié)合發(fā)揮多種生物學效應(yīng)，可誘導(dǎo)促炎癥細胞因子IL-6、TNF-α，趨化因子如MCP-1、MIP-2和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的表達，引起組織細胞局部浸潤、組織破壞和炎癥反應(yīng)，同時對中性粒細胞的增殖、成熟和趨化行為，及T細胞的活化具有協(xié)同刺激作用[3-4]。在皮膚組織中，IL-17可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生TNF-α、VEGF、IL-8、GM-CSF和CXCL10等細胞因子[5]，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和促進血管形成。本研究發(fā)現(xiàn)在尋常型銀屑病皮損中IL-17陽性表達于表皮基底層、棘層和真皮淋巴細胞浸潤區(qū)域，提示IL-17可能與皮損中角質(zhì)形成細胞的異常增殖和淋巴細胞、中性粒細胞的炎性浸潤以及血管的增生形成有關(guān)。

TNF-α在體內(nèi)來源廣泛，單核巨噬細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞和角質(zhì)形成細胞等均可產(chǎn)生，與靶細胞TNFR結(jié)合發(fā)揮多種生物學效能，能誘導(dǎo)IL-1、IL6等炎癥因子釋放，刺激血管內(nèi)皮細胞、角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生多種黏附分子、趨化分子，促進T細胞向炎癥局部趨化游走，加重炎癥反應(yīng)[6-7]，在細胞因子網(wǎng)絡(luò)中居于中心環(huán)節(jié)。我們發(fā)現(xiàn)在尋常型銀屑病皮損中TNF-α陽性細胞廣泛分布于表皮各層和淋巴細胞層，表達水平明顯高于正常皮膚組織，提示致病因素使角質(zhì)形成細胞、淋巴細胞分泌大量TNF-α，誘導(dǎo)炎性T細胞大量增殖活化，向表皮層浸潤，促進表皮增殖。研究已證實TNF-α基因的多態(tài)性與銀屑病發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8-9]。同時我們發(fā)現(xiàn)IL-17和TNF-α在銀屑病皮損中表達呈正相關(guān)，表達位置也基本一致，提示二者在其發(fā)病中具有協(xié)同促進作用，IL-17可能促進角質(zhì)形成細胞分泌TNF-α，促進局部血管形成，加速表皮增殖，加重局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致病程遷延慢性化。目前臨床已開始推廣針對TNF-α和IL-17為治療靶點的生物治療，有望成為治療銀屑病的新途徑。