一株磺化鉆井液降解菌的篩選鑒定及其降解特性

宋淑芬 馬立安 胡傳炯 張照明 周宏 余維初 ，

1.石油石化污染物控制與處理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.長(zhǎng)江大學(xué)；3.非常規(guī)油氣湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心；4.科維生物技術(shù)有限公司；5. 中國(guó)石油工程建設(shè)有限公司

磺化鉆井液是鉆井過程中使用的循環(huán)流體，是液體、固體和化學(xué)處理劑的混合物［1］。為實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)快速鉆井，深井鉆井工程常采用磺化鉆井液體系，導(dǎo)致開發(fā)過程產(chǎn)生的鉆井廢水成為石油行業(yè)難處理的工業(yè)廢水之一［2］，且其廢棄物對(duì)環(huán)境的傷害日趨嚴(yán)重［3-4］，若不經(jīng)有效處理，鉆井廢液會(huì)對(duì)周圍環(huán)境尤其是土壤以及地表水和地下水質(zhì)造成嚴(yán)重污染［5］。當(dāng)前主要采用物化組合工藝對(duì)鉆井廢液進(jìn)行處理［6］，現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用表明，物化工藝化學(xué)藥劑用量大、運(yùn)行費(fèi)用高。目前微生物修復(fù)工藝因其具有投資成本低和無二次傷害等特點(diǎn)，已成為最具價(jià)值和生命力的首選傷害治理工程技術(shù)［7］，在國(guó)內(nèi)外降解有機(jī)物及廢棄鉆井液中已有報(bào)道［8-10］。常用的修復(fù)微生物有無色桿菌、不動(dòng)桿菌、產(chǎn)堿桿菌、節(jié)桿菌、芽孢桿菌、黃桿菌、諾卡氏菌、假單胞菌和棒狀桿菌等［11］。Li等［12］培育出的2株芽孢桿菌和1株不動(dòng)桿菌，也能降解油基磺化鉆井液。

單獨(dú)處理磺化鉆井液污染物耗時(shí)、見效慢且操作復(fù)雜，因此有必要篩選同時(shí)治理多重污染物的菌株。結(jié)合已報(bào)道的鉆井廢液降解菌的篩選、磺化鉆井液無害化處理技術(shù)等［13-14］，不難發(fā)現(xiàn)一些降解菌具有耐受多種污染物的能力，因此篩選單菌同時(shí)治理多重污染是可以實(shí)現(xiàn)的。針對(duì)鉆井過程產(chǎn)生的磺化鉆井廢液的難降解特點(diǎn)，以新疆某磺化鉆井液傷害土壤為菌源，以褐煤樹脂（SPNH）、磺甲基酚醛樹脂（SMP）和復(fù)合離子大分子聚合物（FA-367）三者組成的磺化鉆井液為唯一碳源富集馴化篩選降解磺化鉆井液的單菌，探索其降解特性，為后期構(gòu)建磺化鉆井液降解混合菌劑和研究其傷害土壤生物修復(fù)提供理論指導(dǎo)和微生物資源。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

降解磺化鉆井液的菌源：土壤采自新疆克拉瑪依油田附近離地表15～20 cm被磺化鉆井液傷害的土壤，多點(diǎn)采樣后裝入無菌袋密封保存?zhèn)溆?，樣品取回后在?shí)驗(yàn)室4 ℃下保存。

磺化混合液實(shí)驗(yàn)配方：2%褐煤樹脂（SPNH）+2%磺甲基酚醛樹脂（SMP）+0.5%復(fù)合離子大分子聚合物（FA-367），由大方集團(tuán)重慶分公司提供。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：0.3% NaNO3+0.1% K2HPO4+0.05%KCl+0.05% MgSO4·7H2O+0.0002% CaCl2+0.0001%FeSO4+蒸餾水，pH值7.0～7.2。

磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基+0.2%的磺化混合液。

分離培養(yǎng)基：磺化鉆井液富集馴化篩選降解培養(yǎng)基+1.8%瓊脂。

細(xì)菌富集培養(yǎng)基：0.5%牛肉膏+1%蛋白胨+0.5%NaCl，pH 值 7.0～7.2。

細(xì)菌斜面培養(yǎng)基：細(xì)菌富集培養(yǎng)基+1.8%瓊脂。以上培養(yǎng)基所用試劑均為分析純。

HH-4恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；TE3102S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HVE-50高壓滅菌器，華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司；HFsafe-l200超凈工作臺(tái)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；SPx-250生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ChemStar ATS-03M2數(shù)控恒溫?fù)u床，上海堪鑫儀器設(shè)備有限公司；正置顯微鏡BX63+DP73，奧林巴斯；1.5mL離心管，泰州市誠(chéng)寶醫(yī)療器械有限公司；小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；BIO-RAD Mycycler PCR儀、BIO-RAD POWER PAC200電 泳 儀、BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bi0-Rad（伯樂）公司；DR1010 COD測(cè)定儀（配套消解管），上海世錄儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的馴化、分離 稱取10 g樣品，加入裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，搖床振蕩30 min，打散鉆井液后靜置5 min，取上清液作為菌源。將菌液加入到磺化鉆井液富集馴化培養(yǎng)基，溫度設(shè)為35 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，恒溫培養(yǎng)7 d，此為1個(gè)周期。1個(gè)周期結(jié)束后取10 mL培養(yǎng)液，加入到新鮮的磺化鉆井液培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，馴化時(shí)磺化鉆井液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%遞增，共5個(gè)周期。馴化結(jié)束后將培養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)，取0.2 mL菌液涂布于分離培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱，在35 ℃培養(yǎng)3 d，根據(jù)菌落的大小、形狀、透明度、顏色、隆起程度等特征，對(duì)各個(gè)平板中長(zhǎng)出的單個(gè)菌落進(jìn)行初步篩選。將形態(tài)不同的菌落進(jìn)行劃線分離純化，直至無雜菌生長(zhǎng)。將所得的單菌株接到細(xì)菌斜面培養(yǎng)基上，28～35 ℃培養(yǎng)2 d后于4 ℃冷藏保存。

1.2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)菌株生理生化和分子生物學(xué)鑒定菌株［15］，對(duì)其進(jìn)行分類。DNA提取：用無菌牙簽挑取少量菌體，置于1.5 mL離心管中，加入30 μL去離子水，震蕩使菌體分散，蓋緊離心管，置于微波爐中火加熱2 min，加熱后立即將離心管冰浴2 min，然后將離心管放入離心機(jī)，12 000 r/min離心1 min，吸取離心管液體上清液置于-20℃?zhèn)溆?。以提取的目的DNA為模板，使用通用引物（27F和1492R）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物 27F/1492R（10 μmol/L）各 2 μL，目的 DNA 為 3 μL，ddH2O 為 18 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋耗０錎NA 94 ℃預(yù)變性4 min，模板DNA 94 ℃變性1 min，模板DNA與引物55 ℃退火 1 min，引物 72 ℃延伸 90 s，30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物72 ℃延伸10 min得到PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，交至武漢生工測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并通過MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株的降解特性研究

（1）單因素試驗(yàn)。

①pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)量的影響。

將富集后的菌株接種于磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基，接種量為10%，pH值依次調(diào)為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0，在 35 ℃、150 r/min［15］條件下培養(yǎng)7 d，以菌落形成單位（CFU指單位體積中的活菌個(gè)數(shù)。cfu/mL指的是每毫升樣品中含有的細(xì)菌菌落總數(shù)，下同）方式來確定菌株的最佳生長(zhǎng)pH值。

②鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長(zhǎng)量的影響。

將富集后的菌株接種于磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基，接種量為10%，NaCl添加量依次為：3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，在 35 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)7 d，以菌落形成單位方式來確定菌株的最佳生長(zhǎng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

③搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長(zhǎng)量的影響。

將富集后的菌株接種于磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基，接種量為10%，轉(zhuǎn)速依次調(diào)為90、120、150、180、210、240 r/min，35 ℃培養(yǎng) 7 d，以菌落形成單位方式來確定菌株的最佳生長(zhǎng)轉(zhuǎn)速。

④溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)量的影響。

將富集后的菌株接種于磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基，接種量為10%，溫度依次設(shè)為25、30、35、40、45、50 ℃，培養(yǎng)7 d，以菌落形成單位方式來確定菌株生長(zhǎng)的最適溫度。

⑤接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)量的影響。

將富集后的菌株接種于磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基，接種量依次為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%，在恒溫振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)7 d，以菌落形成單位方式來確定菌株生長(zhǎng)的最適接種量。

⑥N源對(duì)菌株生長(zhǎng)量的影響。

將富集后的菌株接種于磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基，N源依次為NaNO3、（NH4）2NO3、NH4Cl、蛋白胨、牛肉膏，在恒溫振蕩培養(yǎng)器中振蕩培養(yǎng)7 d，以菌落形成單位方式來確定菌株生長(zhǎng)的最適N源。

⑦P源對(duì)復(fù)篩菌株生長(zhǎng)的影響。

將富集后的菌株接種于磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基，P 源依次為 K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4，在恒溫振蕩培養(yǎng)器中振蕩培養(yǎng)7 d，以菌落形成單位方式來確定菌株生長(zhǎng)的最適P源。

（2）正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定菌株接種量10%、P源為K2HPO4、N源為蛋白胨的條件下，選取pH值、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、轉(zhuǎn)速和溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)。在最佳培養(yǎng)條件下，測(cè)定菌株生物量及化學(xué)需氧量（簡(jiǎn)稱COD，指水樣在一定條件下，以氧化1 L水樣中還原性物質(zhì)所消耗的氧化劑的量為指標(biāo)，折算成每升水樣全部被氧化后，需要的氧的毫克數(shù)，以mg/L表示）的降解率。

（3）驗(yàn)證試驗(yàn)。在正交最佳條件下培養(yǎng)7 d，測(cè)Xh8對(duì)磺化鉆井液COD降解效率。

1.2.4 磺化鉆井液COD降解率的測(cè)定 挑取一環(huán)分離純化后獲得的菌株，接種到細(xì)菌富集培養(yǎng)基中，取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的菌液，以10%的接種量接入到磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基中，在35 ℃、pH值 9、150 r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)7 d，測(cè)定COD降解率?；腔@井液COD降解率用DR1010 COD測(cè)定儀測(cè)定。將待檢測(cè)液稀釋10倍混勻，然后用移液管吸取2 mL樣品加入消解管中，擰緊小瓶蓋，輕輕上下顛倒幾次使其混合均勻，采用同樣的方法用等量去離子水作為空白，以未接種的磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基為對(duì)照。再將消解管插入預(yù)先加熱的DR1010反應(yīng)器中，關(guān)上反應(yīng)器蓋子加熱2 h。反應(yīng)完成后，待消解管冷卻至120 ℃以下，取出消解管并輕輕晃動(dòng)幾次，待消解管冷卻至室溫后，將空白消解管插入DR1010 COD測(cè)定儀中歸零，再插入其他待測(cè)定的消解管讀取數(shù)值

式中，C為COD降解率，%；D0為對(duì)照組磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基中COD的質(zhì)量濃度，mg/L；Dx為接菌組磺化鉆井液富集馴化液體培養(yǎng)基中COD的質(zhì)量濃度，mg/L。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 菌株分離篩選結(jié)果

經(jīng)過富集、馴化、分離，從新疆克拉瑪依油田被磺化鉆井液傷害的土壤中分離得到1株具有較好的降解磺化鉆井液效果的菌株，通過形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定命為Xh8（Bacillus flexus），菌落形態(tài)、菌體鏡檢及系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖1，GenBank登錄號(hào)為MK012676。

圖1 Xh8的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Colonial morphology, microscopic morphology and phylogenetic tree of Xh8

2.2 降解特性研究

2.2.1 單因素試驗(yàn)

（1）Xh8生長(zhǎng)最適pH值實(shí)驗(yàn)。從圖2可知，Xh8的最宜生長(zhǎng)pH值為9.5。當(dāng)pH值為7.5～9.5時(shí)，菌株的生長(zhǎng)量隨著pH值的增加而增大，但當(dāng)pH值大于9.5以后，Xh8菌株生長(zhǎng)量急劇下降，說明pH值會(huì)影響微生物體內(nèi)酶的活性，使酶活性中心的某些基團(tuán)和底物的解離程度發(fā)生改變，酶對(duì)底物的結(jié)合能力也隨之發(fā)生改變，從而影響酶對(duì)底物的催化能力。

圖2 Xh8耐pH值實(shí)驗(yàn)Fig. 2 Experiment on pH resistance of Xh8

（2）Xh8生長(zhǎng)最適鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)實(shí)驗(yàn)。從圖3可知，Xh8最高耐受鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)4%。當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于4%以后，菌株生長(zhǎng)量急劇下降，說明在鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低情況下，其分子量較小，容易被生物吸收利用，但在鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的條件下，會(huì)嚴(yán)重地抑制生物的繁殖生長(zhǎng)。

圖3 Xh8耐鹽實(shí)驗(yàn)Fig. 3 Experiment on salt tolerance of Xh8

（3）Xh8生長(zhǎng)最適搖床轉(zhuǎn)速實(shí)驗(yàn)。由圖4可知，Xh8的最宜生長(zhǎng)轉(zhuǎn)速為150 r/min。由于搖床轉(zhuǎn)速的增加，使得降解體系中氧氣的溶解速度增加，在好氧氣培養(yǎng)過程中，有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖。但從圖4發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速超過150 r/min時(shí)，菌株的生長(zhǎng)量慢慢地降低，說明轉(zhuǎn)速過高時(shí)細(xì)菌表面與液體和試管的剪切力會(huì)增大，對(duì)細(xì)菌胞體有一定的損傷，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)不利，因而使得菌體的生長(zhǎng)量降低。

（4）Xh8生長(zhǎng)最適溫度實(shí)驗(yàn)。由圖5可知，Xh8的最宜生長(zhǎng)溫度為35℃。在溫度較低時(shí)，微生物的生長(zhǎng)量隨溫度的提高而增加，但溫度超過35 ℃以后，微生物的生長(zhǎng)量迅速下降，說明高溫會(huì)影響微生物體內(nèi)酶的活性，并且當(dāng)溫度較高時(shí)，可能會(huì)造成酶不可逆的變性，致使微生物體內(nèi)酶失活，微生物發(fā)生熱致死的現(xiàn)象。

圖4 Xh8最適搖床轉(zhuǎn)速實(shí)驗(yàn)Fig. 4 Experiment on the most suitable table rotational speed of Xh8

圖5 Xh8耐溫實(shí)驗(yàn)Fig. 5 Experiment on temperature resistance of Xh8

（5）Xh8生長(zhǎng)最適接種量實(shí)驗(yàn)。由圖6可知，Xh8的最宜生長(zhǎng)接種量為10%。當(dāng)接種量超過10%時(shí)，Xh8菌株的生長(zhǎng)量呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)槌跏冀臃N量過大，微生物的個(gè)數(shù)多，對(duì)底物消耗快，微生物大量繁殖后底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不能維持菌株生長(zhǎng)所需的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，造成新的菌株生長(zhǎng)繁殖受影響；另一方面過量的接種量使得培養(yǎng)基的黏度增加，試管內(nèi)的溶氧量降低，供氧不足使得試管內(nèi)好氧菌種的代謝能力降低，生長(zhǎng)繁殖受阻。

圖6 Xh8最適接種量實(shí)驗(yàn)Fig. 6 Experiment on the most suitable inoculation amount of Xh8

（6）Xh8生長(zhǎng)最適N源實(shí)驗(yàn)。由圖7可知，Xh8的最宜生長(zhǎng)N源為蛋白胨。蛋白胨營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，既含有機(jī)氮化合物，又有一些維生素和糖類可供微生物利用，因而Xh8菌株生物量較高。氮是構(gòu)成生物體的必需元素，因此N源是影響磺化鉆井液降解菌生長(zhǎng)和磺化鉆井液降解菌降解性能的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

圖7 Xh8最適N源實(shí)驗(yàn)Fig. 7 Experiment on the most suitable N source of Xh8

（7）Xh8生長(zhǎng)最適P源實(shí)驗(yàn)。由圖8可知，Xh8的最宜生長(zhǎng)P源為K2HPO4。不同種類的磷酸鹽微生物生長(zhǎng)快慢也不同，說明磷也是微生物生長(zhǎng)的必需元素，因而P源也是影響磺化鉆井液降解菌生長(zhǎng)和磺化鉆井液降解菌降解性能的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

圖8 Xh8最適P源實(shí)驗(yàn)Fig. 8 Experiment on the most suitable P source of Xh8

2.2.2 正交試驗(yàn) Xh8菌株正交試驗(yàn)結(jié)果見表1。pH值的極差R最大，是影響Xh8降解磺化鉆井液COD降解率的關(guān)鍵因子，其次是鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)和溫度，而轉(zhuǎn)速影響最小。因此Xh8降解磺化鉆井液COD最適培養(yǎng)條件為：pH值9.5、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.5%、轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度 35 ℃。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) Xh8菌株在正交試驗(yàn)降解COD最適條件下培養(yǎng)7 d，磺化鉆井液COD降解率22.9%。

表1 Xh8菌株降解磺化鉆井液COD正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Design of COD orthogonal experiment on Xh8 for the degradation of sulphonated drilling fluid

3 結(jié)論

（1）獲得了1株降解磺化鉆井液的芽孢桿菌，命名為彎曲芽孢桿菌Xh8。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示：磺化鉆井液降解菌Xh8的生長(zhǎng)最適條件：pH值為9.5、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為35 ℃，接種量為10%、N源為蛋白胨、P源為K2HPO4。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：磺化鉆井液降解菌Xh8的最佳降解條件：pH值為9.5、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%、轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為35 ℃、接種量為10%，7 d降解率為22.9%。pH的R極差最大，是影響Xh8菌株COD降解的關(guān)鍵因子，其次為鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、溫度、轉(zhuǎn)速。

（2）該磺化鉆井液降解菌株降解性能實(shí)驗(yàn)雖證實(shí)了菌株可降解多種物質(zhì)，但菌株對(duì)磺化鉆井液COD降解能力大小有一定不足，這是降解菌應(yīng)用到傷害治理中的障礙。關(guān)于Xh8菌株對(duì)磺化鉆井液降解特性的研究，僅測(cè)定了1個(gè)周期7 d的降解率22.9%，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，降解效率會(huì)提高。建議下一步進(jìn)行混合菌劑構(gòu)建與土壤修復(fù)試驗(yàn)研究。