sikFBA4基因啟動子的克隆及低溫表達(dá)模式分析

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(農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子832000)

果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-1,6-diphosphate, FBAase)存在于卡爾文循環(huán)(Calvin cycle)、糖異生(gluconeogenesis)、糖酵解(glycolysis)以及磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)等生物體維持正常生命活動所需的代謝途徑中，并在碳、氮代謝及糖代謝等過程中起著極為重要的作用[1]。光合數(shù)學(xué)建模的研究指出，果糖-1,6-二磷酸醛縮酶能夠調(diào)控光合碳代謝的速率[2]。然而到目前為止，對于光合碳流量控制的研究還沒有涉及溫度的因素，實際上溫度對光合酶活性的影響是最直接的。Brüggemann等[3]和Pérez-Torres等[4]的研究表明，來源于不同生境、不同遺傳背景植物的酶，其動力學(xué)特性不同，來源于抗寒植物的酶具有更好的低溫適應(yīng)性。

新疆天山雪蓮(Saussureainvolucrata)屬菊科風(fēng)毛菊屬，生長在海拔2400～4100 m的雪線附近的高山草甸、高山冰磧石和流石灘石隙、懸崖峭壁石縫等處。那里氣候多變，晝夜溫差較大，最高月平均溫3～5 ℃，最低月平均溫-21～-19 ℃[5]，生長環(huán)境極其惡劣。而雪蓮能在這種極端的環(huán)境下快速生長，表明雪蓮具有極強的耐寒、抗輻射、抗缺氧的能力[6-7]。

啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游的一段DNA序列，能夠與RNA聚合酶特異性地結(jié)合并起始功能基因的轉(zhuǎn)錄。啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的一個重要的組成部分，能夠決定基因轉(zhuǎn)錄的起始、效率和時空特異性。在轉(zhuǎn)基因植物研究中，組成型啟動子已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用，但由于組成型啟動子恒定而持續(xù)表達(dá)的特點，造成物質(zhì)和能量的過度消耗和不必要的浪費，使轉(zhuǎn)基因植物常表現(xiàn)出植株矮小，產(chǎn)量和品質(zhì)下降等問題。誘導(dǎo)型啟動子能夠在不同的生境條件下對基因的表達(dá)進(jìn)行精準(zhǔn)的調(diào)控，從而避免基因過量表達(dá)而造成的生物體的失衡。因此，研究誘導(dǎo)型啟動子在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用具有重要的實踐意義。

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，定位于葉綠體的sikFBA4能夠?qū)Φ蜏孛{迫做出敏感的響應(yīng)。因此推測PsikFBA4可能具有在寒冷條件下誘導(dǎo)基因表達(dá)的功能。為進(jìn)一步研究sikFBA4在天山雪蓮中的低溫調(diào)控機制，以天山雪蓮為材料，采用Hi-Tail PCR[8]的方法分離sikFBA4的啟動子序列，并驗證其在冷誘導(dǎo)方面的功能，為冷脅迫下光合碳流量控制的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

天山雪蓮由石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室組培繁殖；本氏煙(Nicotianabenthamiana)由石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室組培繁殖。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR反應(yīng)與sikFBA4的表達(dá)量分析 利用本實驗室天山雪蓮組培苗，于2017年11月對蓮葉座伸展至5葉期的天山雪蓮幼苗進(jìn)行低溫處理，并以正常條件下(19 ℃)的雪蓮組培幼苗作為對照，處理時間分別為1、3、6、12和24 h，每個處理進(jìn)行3次重復(fù)。所有材料在處理后用液氮進(jìn)行速凍并保存于-80 ℃冰箱備用。

根據(jù)已獲得的sikFBA4基因的cDNA序列設(shè)計實時熒光定量引物(表1)，以天山雪蓮的持家基因GAPDH作為內(nèi)參，引物序列參照郭新勇等[9]的研究。分別提取經(jīng)過不同處理的雪蓮組培苗RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。按照SYBR GreenⅠMaster Mix說明書進(jìn)行qRT-PCR，采用相對定量2-ΔΔCt法計算sikFBA4在不同低溫脅迫下的表達(dá)。

1.2.2sikFBA4基因啟動子的克隆 以天山雪蓮組培苗為材料，按照新型植物基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取天山雪蓮的基因組總DNA。

根據(jù)本實驗室已克隆到的雪蓮sikFBA4的基因序列設(shè)計3條嵌套的特異性引物SP1、SP2和SP3，同時合成4條隨機簡并引物L(fēng)AD1～LAD4和一條較短的特異性引物AC1(表1)。

表1 實驗所需引物Table 1 Primers used in this experiment

以雪蓮基因組DNA為模板，利用Hi-Tail PCR擴增FBA4的上游序列。第1輪PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1 μL、隨機簡并引物L(fēng)AD1～4各0.5 μL，引物SP1 0.5 μL，ddH2O 8 μL，2×Easy Taq PCR SuperMIX 10 μL。在第2輪反應(yīng)中，將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為第2輪反應(yīng)的模板，SP1替換為SP2，其余條件不變；在第3輪反應(yīng)中，將第2輪反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍作為模板，SP2替換為SP3，其余條件不變。PCR反應(yīng)程序參考Liu等[8]的方法。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用1%的瓊脂糖凝膠分別對第2輪和第3輪 Hi-Tail PCR 擴增結(jié)果進(jìn)行檢測，選取第3輪結(jié)果中符合大小差異的特異性條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。再將回收產(chǎn)物連接pEasy-T5 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆后，將鑒定為陽性的菌液送北京六合華大基因股份科技有限公司測序。

1.2.3序列分析 序列比對使用DNAMAN 6完成；啟動子序列調(diào)控元件分析以植物順式調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)完成；數(shù)據(jù)處理使用SPSS軟件完成。

1.2.4pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計引物PsikFBA4-F(5′-ggatccATGAAGGCGAGATGGAGAA-3′)、PsikFBA4-R(5′-actagtGTGTGTGTAAGAAGTGAGGC-3′)在PsikFBA4序列上、下游分別引入BamHⅠ和NcoⅠ酶切位點并連入pEASY-T5載體。用BamHⅠ和NcoⅠ雙酶切pEASY-T5-PsikFBA4重組質(zhì)粒和pCAMBIA1304載體，分別回收目的小片段和載體大片段，并用T4連接酶16 ℃連接過夜，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定為陽性克隆后，凍融法轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌GV3101，獲得陽性轉(zhuǎn)化子將其命名為pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS-GV3101。

1.2.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)的在煙草中瞬時轉(zhuǎn)化及GUS酶活力的測定 瞬時轉(zhuǎn)化方法參考穆建強等[10]的研究，但有所改動。將鑒定為陽性的含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌劃線，挑單克隆于加有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)過夜；再將2 mL菌液轉(zhuǎn)入到50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6；3000 r·min-1離心15 min收集菌體，棄上清后用重懸液(10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2、0.2 mmol·L-1乙酰丁香酮)調(diào)整OD值為0.8左右，室溫下靜置3 h待用；取已滅菌的注射器，依靠壓力將菌液注入煙草葉片的葉脈之間，在黑暗條件下保溫、保濕培養(yǎng)24 h之后恢復(fù)正常光照培養(yǎng)24 h(16 h光照，8 h黑暗)。對所有注射過的煙草進(jìn)行冷脅迫處理，處理時間為1、3、6、12和24 h；在不同處理時間點分別用打孔器取樣，分別對樣品進(jìn)行GUS染色和GUS酶活力測定。

GUS染色方法參考Jefferson[11]所用的染色方法，分別將各個材料浸沒于GUS染液中，37 ℃染色16～24 h，使用無水乙醇將葉片中的綠色脫去，觀察染色結(jié)果并拍照保存。

GUS酶活力的測定參考Jefferson[11]建立的熒光定量分析法。樣品用液氮進(jìn)行研磨，并使用GUS抽提液(50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液，10 mmol·L-1EDTA，0.1% Triton X-100，0.1% SDS，10 mmol·L-1β-巰基乙醇)進(jìn)行抽提；使用Bradford[13]的方法測定蛋白濃度；取100 μL蛋白上清加入到400 μL預(yù)熱的GUS提取緩沖液中，再加入500 μL的MUG底物，37 ℃溫浴，分別在0、15、30、45和60 min取反應(yīng)混合物200 μL加入到800 μL的反應(yīng)終止液中，室溫避光保存；用熒光分光光度計在激發(fā)光波長365 nm,發(fā)射光波長455 nm下，狹縫10 nm時測定不同時間點的熒光值；根據(jù)測定的熒光值和蛋白濃度計算出不同脅迫時間處理條件下GUS的酶活力值。

2 結(jié)果與分析

圖1 sikFBA4不同脅迫時間下的相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression of sikFBA4 in low-temperature *：P<0.05；**：P<0.01；T檢驗T test.

圖2 FBA4基因Tail-PCR擴增產(chǎn)物電泳分析Fig.2 Analysis of Hi-Tail PCR of FBA4 M：Marker 3；2:第2輪PCR產(chǎn)物Product of primary PCR；3：第3輪PCR產(chǎn)物Product of secondary PCR；LAD1～4：PCR過程中使用的簡并引物 Degenerate primers.

2.1 sikFBA4在冷脅迫下的表達(dá)情況

以天山雪蓮GAPDH基因為內(nèi)參，利用qRT-PCR法對天山雪蓮經(jīng)4 ℃處理0、1、3、6、12和24 h后葉片中sikFBA4基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。在經(jīng)低溫處理后，sikFBA4的表達(dá)量迅速上升，并在脅迫1 h時，表達(dá)量達(dá)到最大，為正常條件下的10.47倍。在此之后，sikFBA4基因的表達(dá)量雖呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，但整體上仍高于正常水平，在處理3、6和12 h后，其相對表達(dá)量分別為正常水平的6.13、4.01和6.36倍。在對雪蓮處理24 h之后，sikFBA4基因的表達(dá)量與正常條件下的表達(dá)量基本持平。

2.2 Hi-Tail PCR擴增產(chǎn)物電泳

經(jīng)過3輪PCR擴增，LAD1～LAD4均有符合目標(biāo)差異大小的特異性條帶(圖2)，選取大小合適，具有測序意義的條帶進(jìn)行回收并連接pEASY-T5載體進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，擴增后所得FBA4的側(cè)翼序列全長1828 bp。將測序所得序列與FBA基因序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，PCR所得序列3′端與FBA4基因5′端分別有60個堿基的重疊，且所得序列5′端與AC1完全重疊，說明擴增所得DNA片段為雪蓮sikFBA4基因5′端側(cè)翼序列。并將其命名為PsikFBA4。

2.3 天山雪蓮FBA4基因啟動子區(qū)域的生物信息學(xué)分析

序列經(jīng)啟動子分析軟件PlantCARE分析表明：在PsikFBA4中，除含有多個真核生物啟動子必需CAAT-Box和TATA-Box元件之外，還存在許多與光照、激素以及逆境脅迫相關(guān)的調(diào)控元件(圖3)，如：冷脅迫響應(yīng)元件(low temperature responsive element,LTRE)、赤霉素響應(yīng)元件(GA-responsive element,TATC-box)、乙烯應(yīng)答元件(ethylene-responsive element,ERE)、光響應(yīng)元件(cis-acting regulatory element involved in light responsiveness,G-box)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsivenes,TGACG-motif)、熱激響應(yīng)元件(cis-acting element involved in heat stress responsiveness,HSE)等(表2)。

圖3 PsikFBA4主要作用元件分布Fig.3 The cis-elements distribution of PsikFBA4

調(diào)控元件Regulatory sequence序列Sequence生物學(xué)功能Biological function5UTR Py-rich stretchTTTCTTCTCT高轉(zhuǎn)錄水平的順式作用元件Cis-acting element conferring high transcription levelsACECTAACGTATT光響應(yīng)中的順式作用元件Cis-acting element involved in light responsivenessARETGGTTT厭氧誘導(dǎo)必需的順式作用調(diào)控元件Cis-acting regulatory element essential for the anaerobic inductionBox 4ATTAAT參與光響應(yīng)的保守DNA模塊的一部分Part of a conserved DNA module involved in light responsivenessBox ITTTCAAA光響應(yīng)元件Light responsive elementCAAT-boxCCAAT啟動子和增強子區(qū)的共同順式作用元件Common cis-acting element in promoter and enhancer regionsCCAAT-boxCAACGGMYBHv1 結(jié)合位點MYBHv1 binding siteCGTCA-motifCGTCA茉莉酸甲酯順式調(diào)控元件Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsivenessEIRETTCGACC激發(fā)響應(yīng)元件Elicitor-responsive elementEREATTTCAAA乙烯應(yīng)答元件Ethylene-responsive elementG-boxGACATGTGGT參與光響應(yīng)的順式作用元件Cis-acting regulatory element involved in light responsivenessHSEAAAAAATTTC熱應(yīng)激反應(yīng)中的順式作用元件Cis-acting element involved in heat stress responsivenessI-boxATGATATGA光響應(yīng)元件的一部分Part of a light responsive elementMBSCAACTG參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點MYB binding site involved in drought-inducibilityO2-siteGATGACATGA玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控中的順式作用調(diào)控元件Cis-acting regulatory element involved in zein metabo-lism regulationSkn-1_motifGTCAT胚乳表達(dá)所需的順式作用調(diào)控元件Cis-acting regulatory element required for endosperm expressionSp1GGGCGG光響應(yīng)元件Light responsive elementTATA-boxTAAAAATAA-30區(qū)的核心啟動元件Core promoter element around -30 of transcription startTC-rich repeatsATTTTCTTCA防御和應(yīng)激反應(yīng)中的順式作用元件Cis-acting element involved in defense and stress responsivenessTCT-motifTCTTAC光響應(yīng)元件的一部分Part of a light responsive elementA-boxCCGTCC順式調(diào)控元件Cis-acting regulatory elementCCGTCC-boxCCGTCC與分生組織特異性激活相關(guān)的順式作用調(diào)控元件Cis-acting regulatory element related to meristem ncocific activationLTRECCGAAA參與低溫反應(yīng)的順式作用元件Cis-acting element involved in low-temperature responsivenessTCA-elementCCATCTTTT參與水楊酸反應(yīng)的順式作用元件Cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness

2.4 pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建

用BamHⅠ和NcoⅠ雙酶切pEASY-T5-PsikFBA4重組質(zhì)粒和pCAMBIA1304載體，分別回收目的小片段和載體大片段，并用T4連接酶連接過夜，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶切鑒定成功后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，并經(jīng)菌液PCR鑒定成功。

圖4 pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖Fig.4 Construction of plant expression vector pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS NOS-ter： NOS終止子NOS terminator； HygR： 潮霉素抗性基因Hygromycin； CaMV 35S： 35S啟動子35S promoter； PsikFBA4： PsikFBA4啟動子PsikFBA4 promoter； GFP： 綠色熒光蛋白Green fluorescent protein； GUS： β-葡萄糖苷酸酶基因β-glucuronidase gene.

2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的在煙草中的瞬時表達(dá)及不同脅迫時間下酶活力的測定

以GV3101空菌株作為陰性對照，轉(zhuǎn)入pCAMBIA1304-35S-GUS質(zhì)粒的菌株作為陽性對照。利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法注射煙草葉片來分析PsikFBA4在低溫脅迫條件下對報告基因的誘導(dǎo)特性。結(jié)果表明，在陰性對照中未檢測到GUS基因的表達(dá)；在陽性對照組中明顯檢測到GUS基因的表達(dá)；在未脅迫的轉(zhuǎn)PsikFBA4-1304實驗組中檢測到少量的GUS基因的表達(dá)；在經(jīng)過低溫脅迫處理后在轉(zhuǎn)入PsikFBA4-1304的實驗組中能夠明顯檢測到GUS基因的表達(dá)，且表達(dá)量隨著脅迫時間的延長有上升趨勢，GUS染色結(jié)果如圖5所示。

圖5 脅迫處理下GUS染色分析及酶活力的測定Fig.5 GUS activity of transient expression in tobacco during cold stress A:PsikFBA4-GUS-1304實驗組Experimental group;B:P35S-GUS-1304陽性對照Positive control;C:陰性對照 Native control;*:P<0.05;**:P<0.01； T檢驗T test； 4-MU： 4-甲基傘形酮4-methylumbelliferone.

GUS活性定量分析結(jié)果表明，對植株進(jìn)行冷脅迫后，PsikFBA4調(diào)控下的GUS活性隨脅迫時間呈現(xiàn)出先增長后降低的特征。未脅迫的條件下，煙草葉片中的GUS酶活性為1.343 nmol 4-MU·min-1·mg-1；在脅迫1 h后GUS酶活力迅速上升，達(dá)到5.824 nmol 4-MU·min-1·mg-1，上升幅度約為4.33倍，在脅迫6 h時酶活力達(dá)到最大值，為10.598 nmol 4-MU·min-1·mg-1。在此之后，植株中的GUS酶活力開始出現(xiàn)持續(xù)的小幅度下降，并在處理24 h后達(dá)到6.874 nmol 4-MU·min-1·mg-1。與PsikFBA4相比，35S啟動子驅(qū)動下的GUS酶活性在整個脅迫過程中都表現(xiàn)出很高的活性，除在24 h時酶活力有所下降外，其余時間點酶活力基本相同，均維持在10.5～11.5 nmol 4-MU·min-1·mg-1(圖5)。

3 討論

溫度是植物正常生長的必要條件。低溫脅迫幾乎影響植物生命活動的全過程，尤其是光合作用受低溫影響最為顯著[12-13]。因此，培育具有抗寒特性的新品種具有十分重要的現(xiàn)實意義。果糖-1,6-二磷酸醛縮酶在生物體內(nèi)可逆催化果糖-1,6-二磷酸(1,6 fructose diphosphate，F(xiàn)DP)的生物合成，是Calvin循環(huán)和糖質(zhì)新生代謝過程中必不可少的一個關(guān)鍵調(diào)控酶[14]。Uematsu等[15]的研究表明，在煙草中超表達(dá)來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)質(zhì)體的FBA基因，可提高轉(zhuǎn)基因煙草的光合速率，并促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草的生長和生物量的積累。而本實驗室在前期的工作中通過對轉(zhuǎn)sikFBA4基因的番茄(Lycopersiconesculentum)進(jìn)行低溫光適應(yīng)性研究發(fā)現(xiàn)，sikFBA4對提高番茄的抗寒性也具有顯著的作用。

實時熒光PCR結(jié)果表明，sikFBA4對冷脅迫的響應(yīng)十分敏感，表達(dá)量的變化十分劇烈，在脅迫處理1 h后其表達(dá)量達(dá)到對照組的10倍左右，在此之后表達(dá)量隨著時間逐漸降低。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是天山雪蓮在感知冷信號之后產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，通過表達(dá)量的升高來滿足植物機體對冷脅迫的響應(yīng)，而在其對低溫環(huán)境適應(yīng)后，表達(dá)量逐漸下降以減少能量的損耗。sikFBA4對低溫環(huán)境十分敏感的特性，表明sikFBA4在天山雪蓮應(yīng)對低溫脅迫的過程中扮演了重要的角色，而本研究的啟動子序列分析結(jié)果也顯示在PsikFBA4中確實存在著與冷脅迫等逆境相關(guān)的順式作用元件。

sikFBA4基因啟動子的克隆和分析表明，sikFBA4基因啟動子全長為1828 bp，包含有30個CAAT-Box和83個TATA-Box，除此之外還包含有多個與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，如ABRE元件、ARE元件、MBS和LTRE等元件。其中，LTRE是與低溫誘導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CBFs的結(jié)合位點[16-17]，CBFs可通過與啟動子上的順式作用元件結(jié)合而啟動相關(guān)基因的表達(dá)。Jaglo等[18]通過在甘藍(lán)(Brassicaoleracea)和油菜(Brassicanapus)中表達(dá)來自擬南芥CBF1基因，使其抗寒性較野生型有明顯的提高；甄偉等[19]通過在煙草中轉(zhuǎn)入來自油菜的CBF1基因得到了抗寒性明顯提高的煙草植株。因此，植物可通過CBFs來調(diào)控下游大量抗寒相關(guān)基因的表達(dá)來提高植物的抗寒能力。ABRE是脫落酸(ABA)信號通路中的關(guān)鍵順式作用元件。植物在受到低溫脅迫時，體內(nèi)的ABA含量增加[20]，而ABA含量的增加可通過ABA信號通路活化其下游的bZIP轉(zhuǎn)錄因子ABFs，ABFs可通過與ABRE的結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá)[21-25]。因此推測，ABRE順式作用元件的存在可能也是sikFBA4能夠響應(yīng)低溫脅迫的重要原因之一。

為了進(jìn)一步驗證PsikFBA4啟動子在低溫下的誘導(dǎo)特性，本研究構(gòu)建了以GUS為報告基因植物表達(dá)載體并在煙草中進(jìn)行瞬時表達(dá)，瞬時表達(dá)后的GUS染色結(jié)果表明，經(jīng)低溫脅迫后發(fā)現(xiàn)，在PsikFBA4的驅(qū)動下GUS基因的表達(dá)量在未脅迫的情況下僅有少量的表達(dá)，而在經(jīng)過低溫脅迫后GUS基因的表達(dá)量有了顯著的升高。之后的GUS酶活力測定結(jié)果與瞬時表達(dá)后的染色結(jié)果基本一致，表明PsikFBA4具有在低溫條件下誘導(dǎo)報告基因表達(dá)的能力，并進(jìn)一步證明了PsikFBA4是一種低溫誘導(dǎo)型啟動子。

干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫因素能夠誘導(dǎo)植物體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，這一調(diào)控過程的主要機制就是逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子與基因上游的啟動子關(guān)鍵順式作用元件結(jié)合，增強啟動子的活性從而提高相關(guān)目的基因的表達(dá)量。在當(dāng)前的轉(zhuǎn)基因工程中，廣泛使用的是組成型啟動子，但由于組成型啟動子能夠驅(qū)動目的基因在植物的各個組織中恒定而持續(xù)的表達(dá)，而不能從空間和時間上有效的調(diào)控目的基因的表達(dá)，從而過度的消耗植物中的物質(zhì)和能量造成不必要的浪費，并最終影響到植株的正常生長發(fā)育。孟慧等[26]在擬南芥中過量表達(dá)玉米ABP9基因后發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，ABP9過量表達(dá)的植株在種子萌發(fā)，幼苗的生長以及開花階段的生長均受到抑制，同時葉片內(nèi)源ABA含量降低，ABA信號傳導(dǎo)基因表達(dá)增強而ABA合成基因表達(dá)降低，表型受到嚴(yán)重的影響。而誘導(dǎo)型啟動子的利用，則可能實現(xiàn)對外源基因的時、空、量的三維表達(dá)調(diào)控，在提高植物抗逆特性的基礎(chǔ)上保證植物的正常發(fā)育。因此具有經(jīng)濟、環(huán)保及生物安全等多方面的潛在價值。因此，相對于組成型啟動子而言，誘導(dǎo)型啟動子具有更高的實際研究價值。在本實驗中，以具有良好抗寒特性的天山雪蓮為材料，分離出果糖-1,6-二磷酸醛縮酶基因FBA4的上游啟動子序列，并通過實時定量PCR和在煙草中的瞬時表達(dá)確定其為低溫誘導(dǎo)的啟動子，為進(jìn)一步研究天山雪蓮的抗寒機制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實驗通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析了天山雪蓮果糖-1,6-二磷酸醛縮酶基因sikFBA4在低溫脅迫下的表達(dá)模式，并分離出sikFBA4基因的上游啟動子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫的條件下，sikFBA4基因的表達(dá)量顯著升高，在其上游啟動子序列中存在低溫應(yīng)答元件LTRE。接下來構(gòu)建了PsikFBA4與GUS基因的融合表達(dá)載體并在煙草中進(jìn)行瞬時表達(dá)，GUS染色和酶活力測定的結(jié)果顯示在經(jīng)過低溫處理之后GUS基因的活性顯著增強，表明PsikFBA4能夠在低溫脅迫誘導(dǎo)的條件下驅(qū)動下游基因的表達(dá)，為冷誘導(dǎo)型啟動子。為對天山雪蓮sikFBAs基因的表達(dá)調(diào)控機制進(jìn)行進(jìn)一步的研究，接下來要對PsikFBA4啟動子進(jìn)行系列缺失分析，通過構(gòu)建不同長度的缺失表達(dá)載體導(dǎo)入煙草進(jìn)行功能驗證從而確定其核心啟動子區(qū)域。同時構(gòu)建植物表達(dá)載體PsikFBA4-sikFBA4和P35S-sikFBA4導(dǎo)入煙草，比較不同類型啟動子驅(qū)動下外源基因的導(dǎo)入對植物生理指標(biāo)的影響，以期對抗寒植物的培育做出貢獻(xiàn)。