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    多基因檢測在綜合性醫(yī)院分枝桿菌分型中的臨床應(yīng)用

    2018-12-20 03:26:58賈紅兵周誠君
    中日友好醫(yī)院學(xué)報 2018年5期
    關(guān)鍵詞:核酸結(jié)核結(jié)核病

    楊 輝,賈紅兵,李 江,周誠君,王 靖

    (中日友好醫(yī)院 檢驗科,北京 100029)

    分枝桿菌已報道150余種[1],除了麻風(fēng)分枝桿菌 (mycobacterium,leprae)和結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)) ,其余統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌 (non-tuberculous mycobacterium,NTM)。NTM肺病與結(jié)核病有著類似的臨床表現(xiàn),常被誤診為肺結(jié)核。近年來,NTM的分離率和發(fā)病率呈上升趨勢[2]。以分枝桿菌培養(yǎng)及抗酸染色鏡檢為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法不能有效區(qū)分MTB與NTM。另外,諾卡菌屬易與NTM混淆[3]。

    DNA測序是核酸診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,隨著成本降低,測序?qū)⒊蔀槲⑸锖怂釞z測的常規(guī)選項。16S rDNA是是細菌分類研究中最常用的靶序列。分枝桿菌rpoB基因編碼RNA聚合酶β亞基,與hsp65(heat shock protein 65)基因一起作為靶基因在分枝桿菌型屬鑒定中得到廣泛應(yīng)用[4,5]。本研究旨在利用核酸檢測技術(shù),篩查綜合性醫(yī)院臨床分離的分枝桿菌并鑒別菌種。使用16S rDNA基因來篩查分枝桿菌,我們使用rpoB基因來鑒定分枝桿菌菌種,以hsp65基因進行復(fù)核。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株來源

    2015年10月~2016年9月,我院需診斷或除外肺結(jié)核的患者留取痰樣本4467份,排除重復(fù)檢測,關(guān)聯(lián)至就診者2236例,其中抗酸陽性者40例。經(jīng)改良L-J培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2~8周,菌落涂片經(jīng)萋-尼氏染色,鏡檢陽性的菌落經(jīng)16SrDNA測序排除諾卡菌及其他非目的菌,獲得32例分枝桿菌臨床分離株。

    1.1.2 主要試劑和儀器

    改良羅氏培養(yǎng)基購自濟南賽爾生物公司;Blend Taq plus DNA聚合酶購自日本Toyobo公司;瓊脂糖購自西班牙Biowest公司;溴化乙錠購自美國Sigma公司;ABI 9700 PCR儀購自美國應(yīng)用生物信息公司;Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

    1.2 方法

    1.2.1 DNA樣本制備

    參考萬康林團隊的研究文獻[6],在生物安全柜中用接種環(huán)刮取細菌,置于100μl的TE液中混勻,金屬浴 80℃滅活 60min,100℃加熱 30min,立即置于冰上2min,12000r/min離心3min,移上清置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 DNA擴增及測序

    參考前人的研究方法[3,6,7],比較核酸診斷分枝桿菌的種屬特異性保守序列,選擇16S rDNA、hsp65基因和rpoB基因作為本研究的靶序列,PCR引物由上海生工公司合成(見表1)。PCR反應(yīng)體系為 30μl,取 10×含鎂的緩沖液 3μl,2.5 mmol/L 的 dNTPs (dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP)3μl,10μmol/L 引物各 3μl,模板 DNA 3μl,Blend Taq plus DNA聚合酶1U,最后加滅菌水至終體系30 μl。PCR 循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性 5min,94℃變性30s,60℃ 延伸1min,共反應(yīng)35個循環(huán),最后72℃ 延伸 5min。擴增后取5μl PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳后用溴化乙錠(EB)染色10min,并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析。

    1.2.3 PCR產(chǎn)物測序分析

    PCR產(chǎn)物由北京睿博生物公司進行測序。16S rDNA、hsp65基因和rpoB基因3個靶序列信息上傳 NCBI 網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),進行同源性比較分析。序列同源性>97%者即可確定菌型。

    2 結(jié)果

    2.1 菌株篩選

    2015年10月~2016年9月,中日友好醫(yī)院微生物實驗室L-J培養(yǎng)基分離菌落149株,萋-尼氏抗酸陽性者經(jīng)16S rDNA測序確認(rèn)為分枝桿菌32株,均分離自不同的臨床患者痰樣。

    表1 引物序列

    圖1 rpoB與hsp65 PCR產(chǎn)物測序前電泳

    2.2 分枝桿菌分型

    32株分枝桿菌核酸擴增完成后,產(chǎn)物電泳確認(rèn)(見圖1),經(jīng)rpoB基因序列分析,包括結(jié)核分枝桿菌22株,分離率為68.8%,非結(jié)核分枝桿菌10株,分離率為31.2%。10株NTM菌株中,包括膿腫分枝桿菌4株,胞內(nèi)分枝桿菌3株,海分枝桿菌1株,龜分枝桿菌1株,產(chǎn)黏液分枝桿菌1株。hsp65基因測序結(jié)果與rpoB基因測序結(jié)果完全一致。

    3 討論

    肺結(jié)核初診初查大多是由綜合性醫(yī)院完成,但是因為生物安全或結(jié)核專力量不強等原因,綜合性醫(yī)院實驗室分枝桿菌鑒定分型方法未能普遍開展,導(dǎo)致綜合性醫(yī)院分枝桿菌研究相對稀缺。如果預(yù)先對樣本進行菌體滅活,然后提取核酸可以減少生物危害,所以應(yīng)用相對安全的核酸診斷技術(shù),可成為綜合型醫(yī)院今后結(jié)核病篩查、診療工作的重點之一。

    本研究使用了rpoB基因與hsp65基因進行分枝桿菌菌種鑒定,結(jié)果完全一致,但hsp65基因擴增效率較低,其中5株菌進行了二次PCR擴增。其原因可能與我們的核酸樣本制備的方法有關(guān)??紤]到濕熱容易使分枝桿菌滅活,操作須在安全柜內(nèi)操作,所以我們使用了最簡易的生物安全柜內(nèi)熱裂解法。這樣制備的DNA比較破碎,hsp65基因PCR產(chǎn)物片段大,完整的核酸模板數(shù)量少,擴增效率低于rpoB基因。

    本研究分支桿菌的NTM分離率為31.2%,遠高于國內(nèi)同時期結(jié)核病??漆t(yī)院的研究數(shù)據(jù),福州肺科醫(yī)院 NTM 分離率為 10.2%(649/6362)[6],上海肺科醫(yī)院NTM分離率為 10.8%(95/877)[7],新疆自治區(qū)胸科醫(yī)院NTM分離率為4.98%(183/3674)[8],沈陽市胸科醫(yī)院NTM分離率為1.87%(72/3847)[9],重慶公衛(wèi)醫(yī)療救治中心NTM分離率為10.23%(58/567)[10]。數(shù)據(jù)的差異與分支桿菌的地理分布和實驗室檢測手段有關(guān)[11,12],但現(xiàn)行的結(jié)核病防治模式也會對之產(chǎn)生影響。因此在綜合醫(yī)院提高分枝桿菌檢測水平,是規(guī)范結(jié)核病診療的重要環(huán)節(jié)。

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