一例豬水腫病和豬鏈球菌病混合感染的診斷報(bào)告

劉守川，劉 杰，王志紅，薛 瑞，王洋洋，肖亞朋

（洛陽(yáng)中科基因檢測(cè)診斷中心有限公司，河南 洛陽(yáng) 471000）

2018年5月洛陽(yáng)某豬場(chǎng)保育豬出現(xiàn)咳嗽，喘氣、關(guān)節(jié)腫大等癥狀，部分豬有下頜、眼臉腫大的現(xiàn)象。對(duì)1頭發(fā)病豬進(jìn)行剖檢，取病變組織進(jìn)行病原學(xué)鑒定，結(jié)果檢測(cè)出溶血性大腸桿菌、豬鏈球菌。結(jié)合臨床癥狀、病理變化和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為豬水腫病和豬鏈球菌病混合感染。

1 材料與方法

1.1 臨床情況及取樣

圖1 剖檢圖片

某豬場(chǎng)保育豬出現(xiàn)咳嗽、腹式呼吸、關(guān)節(jié)腫大、下頜和眼臉腫大等癥狀，發(fā)病率40%，死亡率30%。選取1頭有下頜、眼臉腫大、腹式呼吸并伴跛行等癥狀的病豬進(jìn)行剖檢。剖檢可見(jiàn)心包積液增多、呈淡的清色，肺臟邊緣有黃色纖維素性滲出物，肺間質(zhì)增寬，腎臟腫大，腸道水腫。根據(jù)臨床癥狀及病理情況分別采集肺臟等組織進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、革蘭氏染色試劑、DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker、細(xì)菌微量生化管及藥敏紙片。

1.3 方法

1．3．1 細(xì)菌分離

無(wú)菌采取病死豬肺臟，分別接于血平板和TSA+血清+NAD培養(yǎng)基，37 ℃，厭氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和常規(guī)細(xì)菌生化試驗(yàn)。

1．3．2 生化鑒定

選取生化鑒定試管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．3．3 16S rDNA 克隆測(cè)序及序列分析

挑取單個(gè)菌落進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析，引物為實(shí)驗(yàn)室常用引物：16S-F1500：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，16S-R1500：5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT，擴(kuò)增出的目的片段大小約為1 500 bp，該引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

PCR采 用50μL反 應(yīng) 體系， 即 10×PCR Buffer 5．0μL、dNTP4．0μL、DNA Taq 酶 1．0μL，16S-F1500/16S-R1500 引 物 各 2．0μL，DNA 模 板 4．0μL，ddH2O 32．0μL。PCR反 應(yīng) 條 件 為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s， 共 30 個(gè) 循 環(huán)；72 ℃10 min。取部分 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1．5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，剩余產(chǎn)物送北京英濰捷基公司測(cè)序，并用MEG7．0進(jìn)行序列分析。

1．3．4 藥敏試驗(yàn)

挑取疑似單個(gè)菌落接種于TSB+血清培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)5～6 h，取100μL均勻涂布于含血清的MH培養(yǎng)基上。用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）[1]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選取頭孢噻呋、阿莫西林、甲砜霉素、硫酸黏菌素、桿菌肽、阿米卡星、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素和氟苯尼考為試驗(yàn)藥物，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，根據(jù)說(shuō)明書(shū)敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株對(duì)所選藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

細(xì)菌初次分離時(shí)平板上有兩種菌落形態(tài)，分別命名為20180630和20180725，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化后，在血平板上，20180630為小而透明菌落，β溶血，革蘭氏染色陽(yáng)性球菌，呈鏈狀，如圖2和圖3；20180725為灰色大菌落，β溶血，呈黏液狀，革蘭氏染色陰性桿菌，如圖4和圖5。

2.2 細(xì)菌 16S rDNA 鑒定結(jié)果

利 用 16S rDNA 檢 測(cè) 引 物 擴(kuò) 增出大小為1．5 kb左右的目的片段，如圖6。對(duì)測(cè)序結(jié)果用DNA STAR軟件處理，并與NCBI中已發(fā)表的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，選取同源性最高菌株的16S rRNA基 因 序 列， 采 用 MEG7．0軟 件 進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖7，從結(jié)果可以看出，20180630 與 streptococcus suis S735同 源 性 為 99．65%， 證 明 該菌 為 豬 鏈 球 菌。20180725與Escherichia coli ATCC 11775 同源性為99．36%，證明該菌為大腸桿菌。

2.3 生化鑒定結(jié)果

從 表1和 表2不 難 看 出 ，201807630發(fā)酵乳糖、菊糖、棉子糖、海藻糖和水楊苷，不發(fā)酵七葉苷、甘露醇和山梨醇；20180725發(fā)酵棉子糖、蜜二糖、甘露醇，對(duì)山梨醇、肌醇，吲哚、VP、苯丙氨酸、檸檬酸鹽、硫化氫呈陰性，產(chǎn)生尿素酶，不產(chǎn)生鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶，能運(yùn)動(dòng)。

圖2 20180630菌落形態(tài)

圖3 20180630革蘭氏染色鏡檢（1 000×）

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

挑取分離到的20180630和20180725進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，20180630敏感藥物為頭孢噻呋、阿莫西林、甲砜霉素、桿菌肽、恩諾沙星、氟苯尼考；20180725敏感藥物為硫酸黏菌素和阿米卡星。

3 總結(jié)

本次檢測(cè)結(jié)果為大腸桿菌和豬鏈球菌混合感染，從臨床癥狀和分離到的細(xì)菌的致病機(jī)理判斷，此次應(yīng)該是豬鏈球菌繼發(fā)大腸桿菌感染，分離到的豬鏈球菌在后續(xù)實(shí)驗(yàn)室鑒定中排除2型豬鏈球菌的可能。豬鏈球菌產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶造成血管中纖維蛋白滲出，附著于臟器表面。豬鏈球菌的感染造成動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降，引起大腸桿菌感染[2]。

臨床上能引起豬纖維素性滲出癥狀的細(xì)菌病有很多，常見(jiàn)的有豬肺疫、傳

圖4 20180725菌落形態(tài)

圖5 20180725革蘭氏染色鏡檢（1 000×）

圖6 細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

圖7 16S rDNA基因全序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表 1 20180630 生化鑒定結(jié)果

表 2 20180725 生化鑒定結(jié)果

表 3 20180630 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

說(shuō)明：S為敏感，R為耐藥，I為中介。下表同。染性胸膜肺炎放線桿菌病、副豬嗜血桿菌病和豬鏈球菌病等[3]，需要對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單了解以便進(jìn)行快速區(qū)分，并且有助于實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離。本次臨床癥狀主要表現(xiàn)為纖維素性滲出，關(guān)節(jié)腫，肺部有病變，傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬肺疫一般很少能引起關(guān)節(jié)腫的臨床癥狀，另外傳染性胸膜肺炎放線桿菌纖維素性滲出主要集中在胸腔，副豬嗜血桿菌雖然引起纖維素性滲出和關(guān)節(jié)腫，但是副豬嗜血桿菌病一般在肺部組織很少有病變出現(xiàn)，表現(xiàn)的都較為健康[4]。

表 4 20180725 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

能夠引起動(dòng)物發(fā)病的大腸桿菌，世界上公認(rèn)的有5種，分為不同的血清型，分別為腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集黏附性大腸桿菌（EAEC）[5]，本次分離的溶血性大腸桿菌與ATCC 11775的同源性為99．36%，ATCC 11735為致病性大腸桿菌（EPEC），但是在實(shí)際臨床情況中豬群并未表現(xiàn)出大規(guī)模的水腫癥狀，所以水腫病可能為個(gè)例，但在實(shí)際用藥過(guò)程中仍需要防范大腸桿菌病的暴發(fā)。因?yàn)榇竽c桿菌是環(huán)境中或動(dòng)物機(jī)體常見(jiàn)菌群，所以在臨床分離細(xì)菌時(shí)容易忽略大腸桿菌，尤其是實(shí)驗(yàn)室人員在不知道臨床癥狀的情況下，容易忽略大腸桿菌作為致病因素的情況，所以在實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離后需要與臨床癥狀進(jìn)行印證，防止出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室病原與臨床癥狀不一致的情況出現(xiàn)。本次分離到的大腸桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，在實(shí)際用藥過(guò)程中應(yīng)注意抗生素的使用方式。

藥敏結(jié)果對(duì)所分離的兩種細(xì)菌有不同的表現(xiàn)，實(shí)際用藥建議使用頭孢噻呋和阿莫西林。阿米卡星使用時(shí)，應(yīng)注意豬群情況，防止加重臨床癥狀，根據(jù)本次細(xì)菌分離情況，病原主要是細(xì)菌病，在使用抗生素的過(guò)程中，需要添加黃芪多糖[6]，防止陰性桿菌釋放內(nèi)毒素造成動(dòng)物應(yīng)激死亡。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室提供的建議，養(yǎng)殖場(chǎng)在使用頭孢噻呋和阿莫西林后，臨床癥狀明顯減輕。