芋頭可溶性酚類(lèi)物質(zhì)及其與芋頭疫病抗性關(guān)系

陳竹芳 莫俊杰 胡漢橋 甄珍 藺中 任磊*

摘? 要：廣泛存在于植物中的酚類(lèi)物質(zhì)具有許多重要功能。本研究收集了不同地區(qū)32個(gè)芋頭（Colocasia Esculenta）品種，鑒定了它們對(duì)疫霉菌（Phytophthora colocasiae）的抗性，選取抗感不同的7個(gè)芋頭品種用高效液相色譜法測(cè)定芋頭中酚類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)及其含量。結(jié)果表明不同芋頭品種對(duì)疫霉菌的抗性差異顯著，大多數(shù)品種感病，2個(gè)抗病。芋頭中含沒(méi)食子酸和蘆丁，不同芋頭品種中沒(méi)食子酸和蘆丁含量差異顯著。葉片沒(méi)食子酸的含量在 529.4～1910.8 ng/g;葉片蘆丁的含量在12247.7～91189.6ng/g之間。沒(méi)食子酸和蘆丁的含量與芋頭的抗病性沒(méi)有相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：芋頭;疫霉菌;高效液相色譜;沒(méi)食子酸;蘆丁

中圖分類(lèi)號(hào)：S-3? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.11974/nyyjs.20181032002

芋頭（Colocasia esculenta（L.）schott），又稱(chēng)芋艿，屬南星科多年生草本植物芋的地下塊莖，是一些熱帶或亞熱帶地區(qū)人們的主要食品。芋頭的種植量在食根作物中位于馬鈴薯、木薯、甘薯和山藥之后，位列第五。芋頭依食用部位不同，分為葉用變種及球莖變種。栽培的芋頭品種主要分為2種類(lèi)型：魁芋類(lèi)，2倍體，植株高大，食母芋為主;多子芋類(lèi)，3倍體，子芋大而多[1]。芋頭疫病由芋疫霉菌（Phytophthora colocasiae Racib）侵染所致。疫病是芋頭生產(chǎn)過(guò)程中的一種主要限制因素，可引起芋頭減產(chǎn)25%～30%[2]。

植物酚類(lèi)化合物是植物次生代謝物的主要類(lèi)型之一，在植物體內(nèi)具有重要的作用。植物體內(nèi)的酚類(lèi)物質(zhì)以自由和共價(jià)的形式存在，自由的酚類(lèi)物質(zhì)稱(chēng)為可溶性酚[3]。已發(fā)現(xiàn)芋頭中總的可溶性酚類(lèi)物質(zhì)的含量與芋頭疫病的抗性相關(guān)[4]。

本研究收集了不同地區(qū)的芋頭品種，鑒定了它們對(duì)疫霉菌的抗病性，選取疫病抗性不同的芋頭品種，用高效液相色譜法測(cè)定芋頭葉片中酚類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)和含量，探討它們與芋頭抗病的相關(guān)性。

1? ? ?材料與方法

1.1? ? ?材料與試劑

選取廣東省、廣西省和湖南省芋頭32品種進(jìn)行抗病性鑒定。阿魏酸、白藜蘆醇、對(duì)香豆酸、綠原酸、蘆丁、沒(méi)食子酸、楊梅素、肉桂酸和鞣花酸均購(gòu)自Sigma Aldrich 公司。甲醇、乙酸、乙腈購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（均為色譜純級(jí)）。水為娃哈哈牌純凈水。

1.2? ? ?儀器設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀;真空干燥箱（上海之信儀器有限公司）。

1.3? ? ?方法

1.3.1? ? ?芋頭的疫病抗病性鑒定

芋頭疫病抗性參考Brooks [2]的方法進(jìn)行，稍作改進(jìn)。培養(yǎng)3～5d的疫霉菌打出直徑為0.5cm的菌塊。接種于第2或第3最嫩的葉片的背面，用透明膠封住菌塊，接種5d后，測(cè)定病斑的直徑，作為芋頭抗疫霉菌的標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)材料接種3張葉片?？共¤b定于2016年在廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.3.2? ? ?標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

稱(chēng)取色譜純級(jí)別的沒(méi)食子酸0.05g，置于10mL的容量瓶中，加入甲醇（色譜純）溶解，定容。濃度為5000mg/L。然后經(jīng)0.2μm孔徑的濾膜過(guò)濾后置于4℃冰箱中避光保存，作為貯備液;使用時(shí)用甲醇（色譜純）稀釋500倍。終濃度為10μg/mL。阿魏酸、白藜蘆醇、對(duì)香豆酸、綠原酸、蘆丁、楊梅素、肉桂酸和鞣花酸的配制方法同沒(méi)食子酸，終濃度為100μg/mL。

1.3.3? ? ?樣品前處理

選芋頭最嫩葉片0.5g，加液氮充分研磨，按De Ascensao的方法提取可溶性酚類(lèi)物質(zhì)[5]。

1.3.4? ? ?色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C 18 柱（4.6mm×150mm，5μm）;流動(dòng)相：乙腈與10%乙酸溶液，梯度洗脫：0 min → 10min→20min→30min → 40min→55min，乙腈35% →40%→ 55% → 80%→0;檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10μL。

2? ? ?結(jié)果與分析

2.1? ? ?芋頭的疫病抗病性

分離出疫霉菌后，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及分子鑒定確定為疫霉菌，以此菌作為接種的病原菌。接種后測(cè)定病斑的直徑，以其病斑直徑的大小作為衡量芋頭抗病性的指標(biāo)。通過(guò)方差分析，差異極顯著，表明不同芋頭品種之間的抗病性存在極顯著差異。參考Singh等[6]離體鑒定芋頭疫病的抗性指標(biāo)，將田間芋頭抗病性的標(biāo)準(zhǔn)定為：直徑小于0.20 cm為抗病，0.21～0.40 cm為中等抗病，大于0.40 cm為感病。不同類(lèi)型的品種中，魁芋有9個(gè)，除3個(gè)表現(xiàn)中抗外，其余均感病;而在22個(gè)多仔芋中，感病12個(gè)，中抗9個(gè)，抗病2個(gè)。從這里可以看出芋頭品種中抗病品種較少，魁芋比多仔芋的抗病性差。選取抗性不同類(lèi)型的材料用于測(cè)定有機(jī)酸的含量。

2.2? ? ?芋頭不同抗性樣品有機(jī)酸種類(lèi)的測(cè)定

將各標(biāo)樣分別取10μl進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)定各自的保留時(shí)間。將抗病品種湘潭-1和感病品種湛江-5的有機(jī)酸的提取物分別取10μl進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。標(biāo)樣中沒(méi)食子酸的保留時(shí)間為3.433±0.00;蘆丁標(biāo)樣的保留時(shí)間為11.854±0.02。而湘潭-1和湛江-5分別出現(xiàn)了保留時(shí)間為3.449±0.04、3.394±0.01和11.909±0.02和 11.935±0.00的峰值，說(shuō)明芋頭中含有沒(méi)食子酸和蘆丁。芋頭沒(méi)有其它種類(lèi)的酚類(lèi)物質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

（a.標(biāo)準(zhǔn)品;b.提取樣品;1.沒(méi)食子酸;2.蘆丁）

2.3? ? ?標(biāo)準(zhǔn)品譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取沒(méi)食子酸和蘆丁5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl，測(cè)定峰面積。對(duì)進(jìn)樣量和峰面積進(jìn)行線性回歸，沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y（峰面積）=1509.5X （進(jìn)樣量）+10.7（R2=0.9972）;蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=3480.6X-2567.6（R2=0.9992）。沒(méi)食子酸和蘆丁的進(jìn)樣量與峰面積相關(guān)極顯著。

2.4? ? ?芋頭沒(méi)食子酸含量的測(cè)定

測(cè)定得到各樣品中沒(méi)食子酸和蘆丁的峰面積值，經(jīng)方差分析，差異均極顯著，不同芋頭品種中沒(méi)食子酸和蘆丁的含量差異明顯。計(jì)算芋頭中沒(méi)食子酸和蘆丁的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。芋頭中蘆丁的含量比沒(méi)食子酸高，每克鮮重葉片蘆丁的含量在12247.7～91189.6 ng/g之間。則每克鮮重葉片沒(méi)食子酸的含量在 529.4～1910.8 ng/g。

分析沒(méi)食子酸和蘆丁的含量與芋頭抗病性（病斑面積）的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們沒(méi)有相關(guān)性。說(shuō)明沒(méi)食子酸和蘆丁含量高并不能提高芋頭的抗病性。

3? ? ?討論

芋頭是一種重要的作物。收集芋頭品種并確定其的疫霉菌的抗性對(duì)該病的防治具有一定的意義。芋頭抗疫霉菌的品種較少，本文所篩選的抗病品種將為提高芋頭的抗病性提供抗病材料。酚類(lèi)物質(zhì)廣泛存在于植物中并且具有多種重要的功能，特別是在抗病方面具有重要的作用[3]。在橡樹(shù)有人認(rèn)為4種酚類(lèi)物質(zhì)可作為由疫霉菌引起的橡樹(shù)抗猝死病抗性的生化指標(biāo)[7]。在芋頭中總的可溶性酚類(lèi)物質(zhì)的含量與芋頭的抗病性相關(guān)[4]。然而植物酚類(lèi)化合物是由多種物質(zhì)組成的，主要由類(lèi)黃酮、酚酸和單寧等3類(lèi)物質(zhì)構(gòu)成。確定它們的組成成份，并確定它們?cè)诳共≈凶饔茫瑢⒂兄诶斫庵参锏目共C(jī)理。目前有關(guān)芋頭酚類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)及其作用還未見(jiàn)報(bào)道。高效液相色譜是檢測(cè)酚類(lèi)物質(zhì)的有效方法。有人用液相色譜分析了水稻莖桿和谷殼中酚類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)，發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸和蘆丁是其主要的2種酚類(lèi)物質(zhì)[8]。本文用9種酚類(lèi)物質(zhì)標(biāo)樣，用高效液相色譜法確定了抗性不同類(lèi)型的芋頭品種中含有沒(méi)食子酸和蘆丁2種酚類(lèi)物質(zhì)。

蘆丁作為一種黃酮類(lèi)化合物，黃酮類(lèi)化合物多數(shù)具有抗菌作用，對(duì)細(xì)菌具有廣泛的抑制活性，能夠保護(hù)植物免受病原微生物侵害[9]。在幾種旱生植物中，總酚和類(lèi)黃酮的含量與抗真菌的活性存在很強(qiáng)的正相關(guān)性[10]。沒(méi)食子酸是酚酸的一種，目前已發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸能有效地抑制真菌的繁殖[11]。本文研究發(fā)現(xiàn)芋頭中沒(méi)食子酸和蘆丁的含量與疫病的抗性沒(méi)有相關(guān)性，其原因可能是：酚類(lèi)物質(zhì)是多種物質(zhì)的混合物，它們共同作用能抑制病原的生長(zhǎng)，但單獨(dú)一種或幾種對(duì)病原物的生長(zhǎng)影響不大;酚類(lèi)物質(zhì)通常與糖或有機(jī)酸結(jié)合形成可溶的共軛物，或者與細(xì)胞壁結(jié)合形成木質(zhì)素。還有部分沒(méi)食子酸和蘆丁共價(jià)接合，沒(méi)能測(cè)定出來(lái)[3]。

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