南蛇藤多萜對(duì)4種化療藥物增效作用的實(shí)驗(yàn)研究

陶 麗 劉延慶

（1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225001； 2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點(diǎn)研究室，江蘇揚(yáng)州 225001）

化療是目前治療癌癥最有效的手段之一，但針對(duì)腫瘤耐藥后出現(xiàn)的疾病進(jìn)展，臨床尚無(wú)替代性的良策，給癌癥治療帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。中醫(yī)藥以其獨(dú)特的診療理論和方法在抗腫瘤治療方面顯示出巨大潛力。雷公藤是臨床最為有效且運(yùn)用最為廣泛的中藥之一，但其治療窗較窄，課題組很早開(kāi)始關(guān)注與雷公藤具有一定親緣性的，功效接近的，但毒性相對(duì)溫和的中藥南蛇藤。南蛇藤（Celastrus orbiculatusThunb.）為衛(wèi)矛科植物南蛇藤的藤莖，始載于清代《植物名實(shí)圖考》，又名過(guò)山楓，具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)止痛、活血解毒等傳統(tǒng)功效。課題組前期發(fā)現(xiàn)南蛇藤乙酸乙酯提取物是其體內(nèi)外抗腫瘤與抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性的有效部位[1-4]。進(jìn)一步通過(guò)活性追蹤、化學(xué)分離與結(jié)構(gòu)鑒定，課題組從該部位富集獲得以五環(huán)三萜為主的南蛇藤多萜（the total terpenoids ofCelastrus orbiculatusThunb.，TTC）[5]。本研究觀察了TTC對(duì)臨床一線化療藥物的體外增效作用，并采用定量藥理學(xué)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，為南蛇藤在腫瘤治療方面的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 A549與H1299人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 藥物 南蛇藤多萜：南蛇藤購(gòu)自廣州致信藥業(yè)，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)中藥資源研究室秦民堅(jiān)教授鑒定為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物南蛇藤的藤莖。取南蛇藤莖藥材10kg，加6倍量90%乙醇，浸泡1h，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙醇得浸膏（0.9kg），加水混懸，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分離乙酸乙酯層，加20%乙醇洗滌3次后將乙酸乙酯層減壓濃縮干燥，獲得南蛇藤多萜總部位220g。以乙酰齊墩果酸進(jìn)行含量測(cè)定，其中獲得二萜、三萜含量達(dá)71.2%（TTC制備工藝已獲授權(quán)發(fā)明專利：200710025343.3）。TTC儲(chǔ)存于4℃冰箱，臨用前用DMSO溶解成100mg/mL的儲(chǔ)液，用不含酚紅的RPMI 1640無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成實(shí)驗(yàn)濃度。紫杉醇注射液（福王）：購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司。注射用鹽酸吉西他濱（澤菲）：購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司。注射用奧沙利鉑（艾恒）：購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。氟尿嘧啶注射液：購(gòu)自天津金耀氨基酸有限公司。以上4種化療藥物用PBS稀釋成100mg/mL的儲(chǔ)液。

1.3 主要儀器與試劑 精密天平，純水儀，倒置顯微鏡（Olympus，日本），EnspireTM多模式微孔板檢測(cè)系統(tǒng)（PerkinElmer，美國(guó)），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Nunc，美國(guó)），RPMI-1640培 養(yǎng) 基 與FBS（Gibco，美國(guó)），二甲基亞砜（DMSO）與3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法測(cè)定TTC單獨(dú)或與化療藥物聯(lián)合用藥的細(xì)胞毒作用 將A549、H1299細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入不同濃度TTC（12.5，25，50，100，200μg/mL）或化療藥物（0.01，0.1，1，10，100μg/mL）或溶劑對(duì)照（DMSO），或分別聯(lián)合使用TTC與各化療藥物，處理48h后，每孔加入5mg/mL的MTT試劑20μL，37℃孵育4h后，小心吸棄上清，加入150μL/well DSMO溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定490nm吸光度，并計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活力。

2.2 Combenefit定量藥理學(xué)軟件評(píng)價(jià)TTC與化療藥物的聯(lián)用效果 采用英國(guó)癌癥研究中心劍橋研究所開(kāi)發(fā)的Combenefit定量藥理學(xué)軟件及Loewe相加模型評(píng)價(jià)2種化合物組合后潛在的藥物相互作用[6]。測(cè)試時(shí)，2種藥物的5種梯度濃度包括溶劑對(duì)照孔以矩陣模式混合。通過(guò)MTT測(cè)定每孔細(xì)胞的相對(duì)增長(zhǎng)率所得響應(yīng)值通過(guò)Combenefit軟件使用以生成劑量-效應(yīng)（D-R）響應(yīng)矩陣以及協(xié)同分布矩陣，并導(dǎo)出可視化結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 TTC與4種化療藥物聯(lián)合用藥劑量確定 為了確定聯(lián)合用藥采用的劑量范圍，實(shí)驗(yàn)首先研究了TTC與4種化療藥物單獨(dú)使用對(duì)A549與H1299兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制活性，并采用作圖軟件GraphPad自帶的Logistic非線性回歸方程擬合量效關(guān)系曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTC與4種化療藥物處理細(xì)胞48h后分別在12.5～200μg/mL與0.01～100μg/mL劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)典型的劑量依賴關(guān)系，其半數(shù)抑制濃度IC50值也基本分布在試驗(yàn)劑量范圍的中間，此時(shí)IC50數(shù)據(jù)計(jì)算相對(duì)精確（見(jiàn)圖1）。因此，在聯(lián)合用藥時(shí)，采用低于TTC自身IC50劑量（3.125，6.25，12.5，25，50μg/mL）與較寬范圍的化療藥物給藥劑量（0.01，0.1，1，10，100μg/mL）進(jìn)行聯(lián)合給藥，觀察低劑量TTC與化療藥物是否存在增敏作用，以及所增敏的化療藥物的劑量區(qū)間。

圖1 TTC與4種化療藥物單獨(dú)給藥對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株體外增殖的影響

圖2 TTC與4種化療藥物聯(lián)合給藥對(duì)A549（A）與H1299（B）細(xì)胞體外增殖的影響

3.2 TTC與4種化療藥物聯(lián)合用藥效果分析 聯(lián)合用藥時(shí)，將5個(gè)梯度TTC劑量（3.125，6.25，12.5，25，50μg/mL）與5個(gè)梯度化療藥物（0.01，0.1，1，10，100μg/mL）連同溶劑對(duì)照（即0μg/mL）以矩陣混合的方式進(jìn)行給藥，因此共產(chǎn)生36種劑量組合。從Combenefit軟件生成的兩株細(xì)胞對(duì)聯(lián)合用藥的響應(yīng)矩陣圖可以看出，聯(lián)合用藥的量效關(guān)系呈現(xiàn)對(duì)角線分布（見(jiàn)圖2）。Loewe相加定量藥理學(xué)藥物相互作用擬合的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TTC與4種化療藥物均能產(chǎn)生一定的協(xié)同作用。其中，TTC在接近IC50劑量（25～50μg/mL）下與高劑量（10～100μg/mL）的氟尿嘧啶產(chǎn)生協(xié)同，而在低于IC50劑量（3.125～25μg/mL）下與低劑量（0.01～10μg/mL）的吉西他濱、奧沙利鉑、紫杉醇產(chǎn)生一定的協(xié)同（見(jiàn)圖2）。因此針對(duì)后3種化療藥物，在采用低劑量的TTC對(duì)其產(chǎn)生增敏作用時(shí)，還允許使用更低的化療藥物劑量。

4 討論

課題組前期針對(duì)多種消化道腫瘤充分證實(shí)南蛇藤提取物體內(nèi)抗腫瘤作用的有效性和初步的安全性[1-3]，因此明確南蛇藤未來(lái)在腫瘤治療中的臨床定位及能夠體現(xiàn)其作用特點(diǎn)的應(yīng)用價(jià)值對(duì)南蛇藤開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。我們注意到，臨床上腫瘤患者首次接觸化療藥物無(wú)效（固有性耐藥）或者接受化療一段時(shí)間內(nèi)有效但再次進(jìn)展時(shí)（繼發(fā)性耐藥）通常不再接受相同藥物治療且無(wú)法采取進(jìn)一步可行性措施，此時(shí)若繼續(xù)給予化療藥物治療，同時(shí)給予中藥治療，可以重新獲得化療療效，即所謂的腫瘤復(fù)敏（re-sensitization）[7]。這為腫瘤耐藥患者的后續(xù)治療生存帶來(lái)一縷曙光，也為中藥抗腫瘤治療提供新的契機(jī)。

為了評(píng)價(jià)南蛇藤多萜能否對(duì)現(xiàn)代常規(guī)化療產(chǎn)生潛在的增效作用，本實(shí)驗(yàn)采用3D可視化的定量藥理學(xué)計(jì)算軟件篩選南蛇藤多萜與化療藥物的聯(lián)合效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTC能在低于其IC50劑量下增強(qiáng)多種一線化療藥物的敏感性，因此在廣譜性的化療增敏劑方面有較為廣闊的應(yīng)用前景?？紤]TTC本身具有一定的抗腫瘤活性，因此其化療增敏作用有可能來(lái)源于作用機(jī)制上的互補(bǔ)性。Combenefit軟件中的Loewe相加模型引入等效劑量的概念，建立了用等效線方法判斷藥物相互作用的指標(biāo)，將藥物相互作用進(jìn)行定量化[8]。利用該軟件Loewe相加模型評(píng)價(jià)并以熱圖方式呈現(xiàn)TTC與四種化療藥物的相互作用，我們發(fā)現(xiàn)這種相互作用在不同的細(xì)胞株中的效應(yīng)分布基本一致，特別是兩種藥物分別在低劑量下聯(lián)用產(chǎn)生大于同等劑量的藥理效應(yīng)，即TTC對(duì)低于治療量的化療藥物產(chǎn)生增敏作用。

在今后的工作中，我們將進(jìn)一步建立符合臨床耐藥進(jìn)展特點(diǎn)的耐藥模型，在此基礎(chǔ)上考察TTC能否實(shí)時(shí)性增強(qiáng)化療藥物的敏感性甚至逆轉(zhuǎn)耐藥模型并達(dá)到最初的敏感性，從而為南蛇藤作為腫瘤復(fù)敏的中藥新藥開(kāi)發(fā)夯實(shí)臨床前數(shù)據(jù)。