基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的腸道病原菌檢測(cè)技術(shù)

陳 瑩（CHEN Ying），胡 蕊（HU Rui），劉穎勛（LIU Ying-xun），王真真（WANG Zhen-zhen），張林艷（ZHANG Lin-yan），顧 兵（GU Bing），李 穎（LI Ying），王 鑫（WANG Xin）

（1徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061；3南京巨鯊顯示科技有限公司市場(chǎng)管理部，江蘇 南京 210036）

腸道感染性疾病重要病原菌，如志賀菌和沙門(mén)菌等感染發(fā)病率高、傳播速度快、耐藥發(fā)生率也高［1-2］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肝硬化［3］、HIV 感染［4］、炎 癥性腸道病［5］以及血糖調(diào)節(jié)［6］等均與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。此外，引起胃腸道感染的食源性致病菌是食品安全的嚴(yán)重隱患［7］，可引起胃腸炎、敗血癥等疾病。因此，快速檢測(cè)威脅人類(lèi)健康的病原菌刻不容緩。目前，臨床常規(guī)的病原菌檢測(cè)技術(shù)多采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)并進(jìn)行生化反應(yīng)及血清學(xué)鑒定等，耗時(shí)繁瑣，檢測(cè)靈敏度低，且檢測(cè)技術(shù)人員的操作水平和經(jīng)驗(yàn)也對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有重要影響［8］。研發(fā)靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行病原菌的快速檢測(cè)，在疾病預(yù)防以及臨床診斷、指導(dǎo)用藥等方面具有重要意義。1985年美國(guó)Kary mullis首次提出聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，該技術(shù)因其高效、靈活以及快速等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。由于傳統(tǒng)PCR技術(shù)存在一定缺陷，為彌補(bǔ)該檢測(cè)方法的不足，一系列基于PCR原理的新型檢測(cè)技術(shù)不斷研發(fā)，為腸道病原菌的鑒定提供了有效的指導(dǎo)與技術(shù)支持。本文就基于PCR技術(shù)原理的腸道病原菌檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行歸納綜述，并分析比較各類(lèi)方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 PCR技術(shù)的基本原理

傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基本思路與DNA的天然復(fù)制過(guò)程相似，包括變性、退火和延伸。擴(kuò)增過(guò)程中，以單鏈DNA為模板，寡核苷酸為引物，在DNA聚合酶的作用下沿5’→3’方向擴(kuò)增DNA片段，使目的基因得以大量復(fù)制［9］（見(jiàn)圖1A）。以腸道病原菌特異性靶基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)PCR引物的設(shè)計(jì)與合成，以臨床微生物樣本的基因組DNA為模板，可實(shí)現(xiàn)腸道病原菌特異性靶基因的PCR快速檢測(cè)。通過(guò)該技術(shù)，可以進(jìn)行12種志賀菌毒力因子的快速檢測(cè)［10］以及該腸道病原菌的耐藥性檢測(cè)［11］。盡管傳統(tǒng)PCR技術(shù)具有高效、靈活以及快速等優(yōu)點(diǎn)（見(jiàn)表1），但是該技術(shù)仍受采樣過(guò)程中無(wú)菌操作、樣品預(yù)處理以及定量不準(zhǔn)確等因素的影響，而作為對(duì)傳統(tǒng)PCR技術(shù)的補(bǔ)充，基于PCR原理的衍生檢測(cè)技術(shù)為腸道病原菌的鑒定提供了有效指導(dǎo)與技術(shù)支持。

圖1 PCR原理圖

表1 不同PCR方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

2 基于PCR技術(shù)的腸道病原菌檢測(cè)

2.1 多重PCR（multiplex PCR，mPCR） Chamberlain于1988年首次設(shè)計(jì)并命名了多重PCR，該方法是普通PCR技術(shù)的延伸，旨在一個(gè)擴(kuò)增體系中添加多對(duì)引物，完成多個(gè)目的片段的擴(kuò)增，達(dá)到同時(shí)進(jìn)行多種靶基因檢測(cè)的目的（見(jiàn)圖1B）。通過(guò)多重PCR技術(shù)，研究者對(duì)志賀菌、侵襲性大腸埃希菌及艱難梭菌進(jìn)行了快速檢測(cè)［12－13］。孟相秋等［14］應(yīng)用該方法，對(duì)腸毒性大腸埃希菌（ETEC）的腸毒素基因STa、STb、LT-I和LT-II同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果證明了該方法的高效性與特異性。Van等［15］成功建立了食源性大腸埃希菌O157∶H7 stx1、stx2靶基因的快速檢測(cè)技術(shù)，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，該方法可將檢測(cè)時(shí)間縮短至2 d。此外，與傳統(tǒng)血清學(xué)方法相比，腸道病原菌如沙門(mén)菌、大腸埃希菌等分型繁多，多重PCR既可以較大程度地提高致病菌的檢出率，同時(shí)還可以鑒定其型別及突變。張曉云等［16］對(duì)比多重PCR與血清凝集法鑒定志賀菌，結(jié)果顯示，前者的檢出率（55.00%）高于后者（33.33%），表明多重PCR技術(shù)有助于提高腸道病原菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性及有效性。此外，有研究團(tuán)隊(duì)［17］結(jié)合多重PCR技術(shù)與基因芯片技術(shù)，進(jìn)一步嘗試致病菌的高通量檢測(cè)。理論上，相較于傳統(tǒng)PCR而言，多重PCR更高效，但李新福團(tuán)隊(duì)在對(duì)比傳統(tǒng)和多重PCR檢出限時(shí)，發(fā)現(xiàn)多重PCR的靈敏度明顯下降［18］。因此，我們通常需要對(duì)多重PCR的反應(yīng)體系，如引物濃度、退火溫度、退火時(shí)間以及DNA聚合酶含量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RTFQ-PCR） RTFQ-PCR 是一種能將核酸放大并同時(shí)進(jìn)行核酸產(chǎn)物檢測(cè)的方法，以TaqMan探針技術(shù)為例，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’→3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，熒光信號(hào)產(chǎn)生，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步（見(jiàn)圖2A）。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的突破，具有更高的靈敏度、特異度及精確性。與傳統(tǒng)PCR方法相比，該方法最大的優(yōu)勢(shì)是全封閉操作以及不需要后續(xù)的分析過(guò)程，顯著縮短了檢測(cè)時(shí)間，并減少了標(biāo)本污染的可能性。Barletta研究團(tuán)隊(duì)曾利用該方法對(duì)志賀菌、沙門(mén)菌和彎曲桿菌進(jìn)行了識(shí)別［19］。胡慧等［20］使用該技術(shù)對(duì)大腸埃希菌O157∶H7特異性基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示純菌檢測(cè)的靈敏度可達(dá)2×10 CFU／mL，同時(shí)假陽(yáng)性率降低，其檢出率是普通PCR的兩倍多。高春燕團(tuán)隊(duì)針對(duì)志賀菌屬侵襲性質(zhì)?？乖璈基因（ipaH）建立了志賀菌快速敏感的熒光定量PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)下限可達(dá)200拷貝／mL［21］。劉生峰等［22］使用基于TaqMan探針的熒光PCR技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌O157∶H7，實(shí)驗(yàn)顯示該方法的線(xiàn)性范圍為102～108CFU／mL，檢測(cè)限達(dá)20 CFU／mL。麻麗丹團(tuán)隊(duì)將 Taqman MGB（Minor Groove Binder）探針技術(shù)與實(shí)時(shí)PCR相結(jié)合，于2 h內(nèi)完成水產(chǎn)品中沙門(mén)菌的檢測(cè)，純菌檢測(cè)限達(dá)13 CFU／mL［23］。

2.3 數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR） dPCR是一種定量分析技術(shù)（見(jiàn)圖2B），擴(kuò)增前首先對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，使含有核酸分子的反應(yīng)體系被劃分為成千上萬(wàn)個(gè)獨(dú)立反應(yīng)室，每個(gè)反應(yīng)室中含有零、一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢靶核酸分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)室，含有單個(gè)模板分子的反應(yīng)室產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，其數(shù)量可通過(guò)絕對(duì)定量的方式讀出，根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例，即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。該方法確保了痕量核酸也可獲得高拷貝的定量結(jié)果［24－25］。

圖2 衍生PCR技術(shù)原理圖

董蓮華等［26］通過(guò)該方法建立了大腸埃希菌O157∶H7的檢測(cè)體系，檢出限可達(dá)10 CFU／mL。此方法除靈敏度高，特異性強(qiáng)外，更有無(wú)需核酸標(biāo)準(zhǔn)品的優(yōu)點(diǎn)。王靜團(tuán)隊(duì)將疊氮溴化丙錠與微滴數(shù)字PCR技術(shù)（ddPCR）相結(jié)合，對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為8.0拷貝／20μL，在檢測(cè)人工污染雞肉樣品時(shí)，最低可檢出102CFU／mL的沙門(mén)菌［27］。Bian等［28］另選擇了油飽和的聚二甲基硅氧烷與ddPCR技術(shù)相結(jié)合，對(duì)致病性大腸埃希菌O157和單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)比RTFQ-PCR技術(shù)，結(jié)果顯示，前者具有高靈敏度的特點(diǎn)，最低檢測(cè)限達(dá)10 CFU／mL，但該方法的缺點(diǎn)是穩(wěn)定性和精密度略低于后者；Suo等［29］成功驗(yàn)證此法，針對(duì)大腸埃希菌O157∶H7、腸炎沙門(mén)菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和空腸彎曲桿菌的不同70聚體寡核苷酸，開(kāi)發(fā)了病原體微陣列檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合多重PCR擴(kuò)增，成功區(qū)分了4種病原體，其檢測(cè)靈敏度為1×10－4ng（約20拷貝）／每個(gè)基因組DNA。

2.4 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 PCR（random amplified polymorphic DNA PCR，RAPD-PCR） 1990年，由Williams建立起來(lái)的一項(xiàng)DNA多態(tài)檢測(cè)技術(shù)—RAPD-PCR，進(jìn)入廣大研究人員視野，該技術(shù)具有多態(tài)性檢測(cè)的特點(diǎn)，打破了傳統(tǒng)PCR技術(shù)使用特定核苷酸序列作為引物的慣例，采用一系列人工合成的隨機(jī)寡核苷酸鏈，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（見(jiàn)圖2C），通過(guò)該技術(shù)可有效研究腸桿菌亞群之間的遺傳性差異，以及尿路感染（UTI）大腸埃希菌多重耐藥分離株的遺傳分型［30－31］。此外，Alni等［32］利用該技術(shù)對(duì)人、牛和食品樣品中分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行基因分型，確定分離株之間的遺傳關(guān)系，從而進(jìn)行感染流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)與控制。

2.5 基因組重復(fù)序列 PCR（repetitive element PCR，rep-PCR） rep-PCR是利用設(shè)計(jì)好的引物擴(kuò)增目標(biāo)DNA間高度保守的重復(fù)序列，得到不同區(qū)域間的擴(kuò)增圖譜，分析目標(biāo)基因組的多態(tài)性。該方法具有高分辨力，常用于病原菌的分子分型、基因圖譜制作、溯源性的系統(tǒng)分析等，其中腸桿菌基因間重復(fù)共有序列-PCR（ERIC-PCR）是重要的檢測(cè)方法之一。Ranjbar等［33］應(yīng)用ERIC-PCR對(duì)地表水大腸埃希菌菌株的基因組指紋圖譜進(jìn)行分析；Abakpa研究小組應(yīng)用該方法對(duì)從蔬菜、灌溉水等440份樣本中分離的耐藥性大腸埃希菌O157∶H7進(jìn)行指紋圖譜分析，揭示了發(fā)展中國(guó)家耐藥性菌株的傳播威脅［34］。張輝團(tuán)隊(duì)利用此方法對(duì)分離自食品及住院患者的大腸埃希菌菌株進(jìn)行檢測(cè)，為防控食源性大腸埃希菌引起的疾病提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但該方法也有不足之處，如對(duì)反應(yīng)體系要求較高［35］。

2.6 不對(duì)稱(chēng) PCR（asymmetric PCR，aPCR）aPCR技術(shù)其反應(yīng)原理和操作步驟與傳統(tǒng)PCR相似，主要區(qū)別是體系中添加了不等量的一對(duì)引物。在DNA聚合酶的催化下，通過(guò)對(duì)不等量引物結(jié)合的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，在擴(kuò)增前期其產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，而擴(kuò)增后期則為大量單鏈DNA［36］。因不存在互補(bǔ)雙鏈的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使得該方法的雜交效率及檢測(cè)靈敏度提高［37－38］。王小強(qiáng)團(tuán)隊(duì)利用多重不對(duì)稱(chēng)PCR技術(shù)結(jié)合基因芯片技術(shù)，建立了一種可同時(shí)檢測(cè)7種常見(jiàn)食源性致病菌的方法，并使基因組DNA的檢測(cè)靈敏度達(dá)0.1～1 pg，該方法提供了一種特異性檢測(cè)單一和混合感染目標(biāo)菌的手段［39］。

2.7 免 疫 捕 捉 PCR（immuno-capture PCR，ICPCR） IC-PCR是免疫捕捉與傳統(tǒng)PCR相結(jié)合的一門(mén)技術(shù)，在傳染病診斷、流行病學(xué)調(diào)查等諸多領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。該方法首先將特定抗原微生物通過(guò)固相或均相抗體特異性捕捉，之后通過(guò)加熱等步驟完成PCR模板的制備，再利用基因組序列特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而對(duì)樣本中的病原微生物進(jìn)行定性或定量分析（見(jiàn)圖3A）。張?bào)w銀等［40］采用免疫捕捉－通用引物PCR（IC-UPPCR）對(duì)食品中的沙門(mén)菌進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)2×102CFU／mL，該技術(shù)表現(xiàn)出特異性好、靈敏度高和高通量等特點(diǎn)，適用于食品衛(wèi)生監(jiān)管以及臨床診斷等領(lǐng)域。高濤團(tuán)隊(duì)將免疫磁珠捕獲－通用引物PCR（IMC-UPPCR）與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示免疫捕捉PCR與傳統(tǒng)培養(yǎng)法符合率達(dá)93.22%［41］，說(shuō)明該方法還有進(jìn)一步的發(fā)展空間和廣闊的應(yīng)用前景。

2.8 巢式PCR（nested-PCR） nested-PCR又稱(chēng)套式PCR，即通過(guò)兩對(duì)PCR引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，得到完整的目的片段。利用第一對(duì)PCR引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，之后利用第二對(duì)引物（即巢式引物，設(shè)計(jì)于第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)部）進(jìn)行二次擴(kuò)增，第二對(duì)引物可結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物的內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增片段（見(jiàn)圖3B）。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，可避免由于環(huán)境污染造成的假陽(yáng)性結(jié)果，成本也相對(duì)較低。樊琛研究小組通過(guò)套式PCR技術(shù)檢測(cè)了10株大腸埃希菌的iss基因，并探討該技術(shù)的檢測(cè)缺陷和改進(jìn)方法［42］。陳愛(ài)平等［43］通過(guò)該方法對(duì)外環(huán)境水中的致病霍亂弧菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在保證霍亂監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)靈敏度的同時(shí)，有助于追蹤霍亂的傳播趨勢(shì)。樊曉琳等［44］通過(guò)nested-PCR對(duì)水產(chǎn)品中的副溶血弧菌進(jìn)行快速檢測(cè)，結(jié)果表明該方法對(duì)副溶血弧菌純培養(yǎng)物的檢測(cè)限為6.62 CFU／mL，對(duì) DNA 的檢測(cè)限為200 fg，且該方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法結(jié)果一致，但檢測(cè)時(shí)間更具優(yōu)勢(shì)。

圖3 衍生PCR技術(shù)原理圖

2.9 雙啟動(dòng)寡核苷酸PCR（dual priming oligonucleotide PCR，DPO-PCR） DPO-PCR 是一種融合新型引物設(shè)計(jì)方法，進(jìn)行靶基因快速檢測(cè)的新技術(shù)。在該技術(shù)中，DPO引物由三個(gè)區(qū)域組成：較長(zhǎng)的5’-區(qū)段、較短的3’-區(qū)段，以及橋接5’-和3’-區(qū)段的聚肌苷酸［poly（I）］連接物［45］。該檢測(cè)技術(shù)可以有效消除錯(cuò)配引發(fā)，從而提高PCR擴(kuò)增的特異性，其檢測(cè)結(jié)果要比傳統(tǒng)PCR方法更精確。該方法可有效檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌O157∶H7，其檢測(cè)靈敏度低至94 CFU／mL［46］。針對(duì)致病性大腸埃希菌，李丹丹研究小組建立的DPO-PCR檢測(cè)體系，其靈敏度為97 CFU／mL［47］，上述實(shí)驗(yàn)為精準(zhǔn)、快速檢測(cè)大腸埃希菌提供了新的檢測(cè)思路。此外，基于DPO-多重PCR技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行沙門(mén)菌、空腸彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、志賀菌及小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的快速檢測(cè)，為食源性病原菌的快速檢測(cè)提供了有效檢測(cè)手段［45］。

3 其他PCR技術(shù)

其他基于PCR原理的腸道病原菌檢測(cè)技術(shù)包括與新興檢測(cè)技術(shù)結(jié)合的檢測(cè)方法，如隨機(jī)PCR結(jié)合基因芯片技術(shù)［48］、多重PCR結(jié)合基因芯片技術(shù)［17，49］、傳統(tǒng)PCR與變性高效液相色譜法結(jié)合的多重PCR-DHPLC技術(shù)［50－51］、PCR 技術(shù)結(jié)合免疫層析技術(shù)（PCR-ICT）［52］和多重?zé)晒釶CR結(jié)合 Allglo探針技術(shù)［53］，上述技術(shù)在腸道致病菌，如致瀉性大腸埃希菌、艱難梭菌等的快速檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用。

4 討論

PCR技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等領(lǐng)域，如臨床疾病診斷，細(xì)菌、病毒以及寄生蟲(chóng)定性和定量檢測(cè)等方面取得了巨大成就［54－57］，并成為常用臨床快速檢測(cè)方法之一。由于傳統(tǒng)PCR技術(shù)存在易交叉污染、產(chǎn)生假陽(yáng)性及定量不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)，已經(jīng)不能滿(mǎn)足人們的檢測(cè)需求。研究人員研發(fā)的各種基于PCR原理的衍生技術(shù)，可針對(duì)PCR各方面的性能進(jìn)行不斷地突破：如將變性高效液相色譜及量子點(diǎn)免疫層析技術(shù)與 PCR 技術(shù)相結(jié)合［50，58］，提高了檢測(cè)速度與靈敏度；將傳統(tǒng)瓊脂糖電泳替換成基于測(cè)序儀的熒光毛細(xì)管電泳，提高了分辨性［59－60］，解決反應(yīng)產(chǎn)物處理后的污染問(wèn)題；將熒光基團(tuán)引入引物擴(kuò)增便于進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，改進(jìn)了時(shí)效性［61］并避免相關(guān)物質(zhì)的干擾。盡管現(xiàn)有PCR衍生技術(shù)自身仍存在不足，還需要在檢測(cè)成本、穩(wěn)定性等方面進(jìn)行優(yōu)化，然而在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷中，這些方法因其具有的顯著優(yōu)勢(shì)，仍將發(fā)揮重要的作用?？傊?，隨著創(chuàng)造性地將PCR及其衍生技術(shù)與現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)新技術(shù)相結(jié)合，以及生物芯片、質(zhì)譜、拉曼光譜等新技術(shù)的不斷推廣及檢測(cè)水平的不斷提升，PCR技術(shù)的限制正在逐漸被打破，在腸道病原菌檢測(cè)方面的應(yīng)用價(jià)值也得到了更大程度的體現(xiàn)，并在感染控制、衛(wèi)生預(yù)防、食品安全監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮著巨大作用。