抑制奶牛乳腺炎致病菌的中藥復方篩選及其抗炎效果研究

榮霞，王自力，張翥，涂君平，魏學良，金美蘭，別應堂，張家驊

(1.西南大學動物科技學院，重慶 400716；2. 重慶市璧山區(qū)大興鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶 404000；3. 重慶市光大(集團)有限公司，重慶 400020)

?

抑制奶牛乳腺炎致病菌的中藥復方篩選及其抗炎效果研究

榮霞1，2，王自力1，3*，張翥1，涂君平1，魏學良1，金美蘭1，別應堂3，張家驊1

(1.西南大學動物科技學院，重慶 400716；2. 重慶市璧山區(qū)大興鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶 404000；3. 重慶市光大(集團)有限公司，重慶 400020)

為研究可有效抑制奶牛乳腺炎主要致病菌的中藥復方及其抗炎效果，通過對黃連、黃柏、赤芍、苦參、連翹等5味中藥進行正交試驗設計組方，采用平板打孔法、試管二倍稀釋法分別研究了各單味中藥及其復方對金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌的體外抑菌效果，同時研究了篩選出的中藥復方的不同劑型對二甲苯致小鼠耳腫脹的急性炎癥和棉球致肉芽腫的慢性炎癥的抑制效果。結果表明，對5味中藥的敏感性強弱依次為對無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌；中藥方劑3和方劑7對4種細菌的體外抑菌活性較強，且以方劑3的搽劑及膏劑對急、慢性炎癥具有良好的抑制效果。

奶牛乳腺炎；中藥復方；抗菌；抗炎

目前，我國奶牛乳腺炎的發(fā)病率較高，臨床型奶牛乳腺炎平均發(fā)病率為33.41%，隱性乳腺炎的平均陽性率為73.91%，乳房患病率為44.74%[1]，其主要致病菌為金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌[2-3]。雖然用抗生素治療奶牛乳腺炎可取得較好的療效，但易導致藥物殘留和耐藥菌出現，嚴重危害奶業(yè)健康生產和公共衛(wèi)生安全。因此，研制低毒、低殘留且安全的中藥制劑來防治奶牛乳腺炎是重要的研究熱點之一[4]。本研究選取黃連、黃柏、赤芍、連翹、苦參等中藥，研究中藥及其復方對乳腺炎主要致病菌的體外抗菌活性及抗炎效果，為研制防治奶牛乳腺炎藥物提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性昆明小鼠(22～25 g)70只，雌雄各半。隨機分為7組：陰性對照組(基質搽劑組，基質軟膏組)，陽性對照組(地塞米松組)，中藥復方組(方劑3和方劑7)搽劑組及軟膏組，每組10只。

1.2 藥品與試劑 黃連、黃柏、赤芍、連翹、苦參，均購自重慶市桐君閣大藥房。乙二胺四乙酸二鈉、液態(tài)石蠟，甘油，三乙醇胺，吐溫20、地塞米松、二甲苯、乙醚、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、十二烷基硫酸鈉、羥苯乙酯等均購自成都市科龍化工試劑廠。

金黃色葡萄球菌，由西南大學動物科技學院微生物學實驗室保存；無乳鏈球菌(CVCC1886)，停乳鏈球菌(CAU0586)，大腸桿菌(CVCC1560)，均購自中國獸藥監(jiān)察所菌種保藏中心。

1.3 儀器與設備 RE-52A型旋轉蒸發(fā)器、GHP-9080型隔水式培養(yǎng)箱、THZ-C型恒溫振蕩箱、722S可見分光光度計、SW-CJ-1Bμ型無菌工作臺。

1.4 方法

1.4.1 中藥提取及制劑 參照文獻方法[5]煎煮及提取藥物，即稱取相應中藥，加水煮沸3次，雙層紗布過濾后，分別經60%、80%無水乙醇于4℃醇沉12 h，3000 rpm離心15 min后，取上清液經減壓旋轉蒸發(fā)濃縮至1 g生藥/mL。同時，參照文獻[6]制作軟膏基質，將中藥提取液加入軟膏基質混勻，制作成1 g生藥/g基質的膏劑；另將乙醇、氮酮、吐溫20、蒸餾水按一定比例制成搽劑基質，再與中藥提取液配制成1 g生藥/mL基質的中藥搽劑，置于4℃保存。

1.4.2 正交試驗設計 根據體外抑菌試驗結果，考察黃連、黃柏、赤芍、連翹和苦參的醇沉水提物不同水平組方對奶牛乳腺炎主要致病菌的體外抑菌效果，選用正交表L8(25)。水平參照單味中藥(因素)的最大MBC值，中藥復方組成、水平和試驗表頭設計見表1和表2。

表1 中藥復方組成因素和水平

表2 試驗表頭設計及方案

1.4.3 中藥抑菌效果測定 參照文獻方法[7]，采用平板打孔法進行測定。

1.4.4 中藥最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測定 參照文獻方法[8]，采用二倍稀釋法和平板計數法進行測定。

1.4.5 抗炎效果研究

1.4.5.1 急性炎癥的抗炎效果研究 采用二甲苯致鼠耳腫脹法[9]制作急性炎癥模型。即在每只小鼠右耳涂抹二甲苯0.03 mL，致炎0.5 h后，基質組鼠左右耳涂抹基質；給藥組鼠左耳涂抹基質，右耳涂抹復方中藥制劑，給藥4 h后，用直徑為6.0 mm的打孔器分別在小鼠兩耳同部位打下圓耳片，立即稱重，分別計算腫脹度和腫脹抑制率。

耳腫脹度=M(右耳片)-M(左耳片)(M為質量)

腫脹抑制率(%)=[(對照組腫脹度-給藥組腫脹度)/對照組腫脹度]*100%

1.4.5.2 慢性炎癥的抗炎效果研究 采用小鼠棉球肉芽腫法[9]制作慢性炎癥模型。即用乙醚吸入麻醉小鼠后，于無菌操作條件下將滅菌棉球(5mg)分別植入小鼠左右腋窩皮下，縫合皮膚；于術后次日給各組小鼠腋下棉球皮膚處均勻涂抹0.03mL藥物搽劑或0.03g藥物膏劑，連續(xù)給藥7d，每天2次。末次給藥1h后頸部脫臼處死小鼠，取出各組棉球肉芽組織，剔除脂肪組織后于80℃烘干12h至恒重，按如下公式計算肉芽腫組織重及增生抑制率：

肉芽組織重=植入棉球肉芽腫平均重量-植入棉球初重

增生抑制率(%)=[(對照組肉芽腫重量-給藥組肉芽腫重量)/對照組肉芽腫重量]*100%

1.5 數據處理及分析 數據采用SPSS19.0分析軟件進行統計分析，以平均值±標準差(x±SD)形式表示。

2 結果

2.1 單味中藥及其復方體外抑菌效果 由表3可知，金黃色葡萄球菌對5種中藥的敏感度順序為：黃連、赤芍、苦參、連翹；無乳鏈球菌的敏感度順序為黃連、赤芍、連翹、黃柏、苦參，且對除苦參外的4味中藥高度敏感；停乳鏈球菌的敏感順序為黃連、黃柏、連翹、赤芍；大腸桿菌的敏感順序為黃連、赤芍、連翹；黃柏僅對鏈球菌有抑制作用；苦參僅對金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌有抑制作用。

表3 5種中藥提取物對奶牛乳腺炎主要致病菌的抑菌效果(mm)

注:”—”表示無抑菌圈。所打孔孔徑為7 mm，抑菌直徑<10 mm為低度敏感，10～14 mm為中度敏感，15～19 mm為高度敏感，20 mm及以上為極敏，下同。

由表4可知，黃連對四種致病菌的MIC值最低，在0.0078～0.0625 g/mL之間?？傮w而言，5味中藥對鏈球菌的MIC值較低，尤其是黃連和黃柏；苦參的抑菌范圍較窄，僅對金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，MIC為0.25 g/mL。

表4 5種中藥提取物對奶牛乳腺炎主要致病菌的抑菌效果(g/mL)

由表5所示，8個中藥復方對4種供試菌株均表現一定程度的抑制作用。其中，以方劑1、方劑3、方劑4、方劑7對金黃色葡萄球菌的MIC值較小，以方劑1、方劑3、方劑4對無乳鏈球菌的MIC值較小，以方劑1、方劑3、方劑5、方劑7對停乳鏈球菌的MIC值較小，以方劑2、方劑3、方劑7對大腸桿菌的MIC值較??；以方劑1、方劑3、方劑7對金黃色葡萄球菌的MBC較小，為方劑3、方劑4、方劑5對無乳鏈球菌的MIC值較小，以方劑1、方劑3、方劑5、方劑6、方劑7、方劑8對停乳鏈球菌的MIC值較小，以方劑4、方劑1、方劑3、方劑7對大腸桿菌的MBC值較小。因此可知，以方劑3和方劑7對各致病菌具有較好的抑制作用。

表5 中藥提取物復方對奶牛乳腺炎主要致病菌的抑菌效果(g/mL)

由表6可知，直觀分析結果表明，對金黃色葡萄球菌的5味中藥的兩水平間極差均為0，各因素之間無主次之分；對無乳鏈球菌，黃連、赤芍和連翹的水平極差較大，最佳組方為A1B2C1D1E1；對停乳鏈球菌，黃柏、赤芍、連翹的水平極差較大，最佳組方為AB2C1D1E；對大腸桿菌，苦參的水平極差較大，且以1水平對大腸桿菌的抑制作用最強，最佳組方為A1B2C2D1E1。根據對以上各菌影響的主次順序綜合分析可知，中藥最佳組方為A1B2C1D1E1，最為接近的為方劑3(A1B1C1D1E1)。

2.2 中藥提取物復方的抗炎效果研究

2.2.1 對急性炎癥的抗炎效果

表6 不同組成的中藥提取物復方對奶牛乳腺炎主要致病菌抑菌效果的直觀分析

續(xù)表

注：表中a代表金黃色葡萄球菌，b代表無乳鏈球菌，c代表停乳鏈球菌，d代表大腸桿菌。

由表7可知，與基質組相比，方3和方7搽劑組小鼠耳腫脹度均極顯著低于基質組(P<0.01)，腫脹抑制率分別為54.7%、49.8%且低于地塞米松組；而方劑3和方劑7膏劑組與基質組小鼠耳腫脹度無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 對慢性炎癥的抗炎效果

表7 中藥提取物復方對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(n=10)

注：與基質組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

由表8所示，與基質組相比，方劑3和方劑7搽劑組小鼠肉芽腫重量均低于基質組，但無顯著差異(P>0.05)；方劑3軟膏組小鼠肉芽組織重顯著低于基質組(P<0.05)，腫脹抑制率為40.4%，方劑7膏劑組則無顯著差異(P>0.05)。

表8 中藥提取物復方對小鼠棉球致肉芽腫的影響(n=10)

3 討論與小結

根據中獸醫(yī)理論可知，奶牛乳腺炎是由于胃熱壅盛、氣血凝滯、胃脈受阻、乳腺靜脈阻塞或不暢而發(fā)生的[10]。從病原學上看，奶牛乳腺炎是由微生物感染引起的，其中以金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌為主，占感染病例的90%以上。因此，針對奶牛乳腺炎的發(fā)病機制和發(fā)病特點，本研究選用了具有清熱解毒、抗菌消炎、活絡通乳、消腫等功效的黃連、黃柏、赤芍、連翹和苦參[11]，比較各單味藥及其復方對奶牛乳腺炎主要致病菌的體外抑菌活性強弱及抗炎效果。

3.1 單味藥及復方的體外抑菌效果

本研究采用平板打孔法和二倍稀釋法考察5種中藥對奶牛乳腺炎主要致病菌的體外抑菌活性，以確定各致病菌對不同中藥的敏感性及敏感程度。有研究表明，連翹、黃柏、黃連對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及鏈球菌具有抑菌作用[12]，且黃連主要有效成分小檗堿具有體內抑菌效果[13]。試驗結果表明，黃連、黃柏、赤芍、連翹、苦參等5味清熱藥對革蘭氏陽性菌的抗菌活性強于革蘭氏陰性菌。其中，以黃連的抑菌活性最強，對四株致病菌均表現為高敏，連翹、赤芍的對大腸桿菌抑菌活性較強，苦參對金黃色葡萄球菌具有一定抑制作用，黃連、黃柏、赤芍、連翹對鏈球菌抑制作用較好。

通過正交設計進行組合中藥復方，考察復方對奶牛乳腺炎致病菌的MIC和MBC，MIC值越小，抑菌活性越強。本研究表明，各個復方對4種奶牛乳腺炎致病菌均有較強的抑菌活性。根據中獸醫(yī)學理論選用的中藥組成的中藥復方制劑對隱性乳房炎有一定的治療效果[14]。直觀分析得出，最佳組方為A1B2C1D1E1，即以方劑3對各菌的體外抑菌效果較好。方劑3的各單味中藥濃度均為最大水平，即一定濃度范圍內，中藥濃度越高，抑菌活性增強。此外，方劑3的濃度比例為2∶2∶2∶2∶1，方劑7的濃度比例為1∶1∶1∶2∶1，即黃連：黃柏：赤芍為1∶1∶1，其配比可能具有協同作用，同時這三味中藥分別對四種菌有較強的抑菌活性，在復方中發(fā)揮著重要的協同抑菌作用。因此，本研究選用方劑3、方劑7作為受試中藥復方進行抗炎試驗。

3.2 不同劑型中藥復方的抗炎效果

目前防治奶牛乳腺炎的藥物劑型以透皮劑為主，中藥透皮給藥具有療效好、毒副作用小、無肝首過效應等優(yōu)點[15]，對治療奶牛乳腺炎有廣闊的臨床應用前景[16]。在本研究中，采用氮酮為透皮促滲劑制作中藥復方搽劑，同時制作膏劑以研究其抗炎效果。

本研究表明，針對二甲苯引起小鼠耳廓腫脹的急性炎癥，中藥復方搽劑效果優(yōu)于膏劑，且以方劑3效果最好；針對干棉球引起的肉芽腫的慢性炎癥，中藥復方膏劑效果優(yōu)于搽劑，亦以方劑3效果最好。研究表明，氮酮作為透皮劑，可迅速滲入皮膚角質層，脫去細胞間脂質形成孔道，增加角質層含水量，降低角質層的相轉變溫度，增強藥物的滲透作用[17]。因此，中藥搽劑具有藥物吸收較快、藥效快、對急性炎性效果較好的特點；而膏劑具有藥物作用時間長、藥效穩(wěn)定特點，主要用于慢性疾病的治療[18]，故對慢性炎癥效果較好。

同時，方劑3的搽劑及膏劑抗炎效果均優(yōu)于方劑7，且方劑3中黃連、黃柏及赤芍藥物含量高于方劑7。根據文獻報導，黃連的主要有效成分是黃連堿，具有抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥反應作用；黃柏煎劑具有明顯的抗炎效果[19]；且赤芍具有抗炎、鎮(zhèn)痛功效[20]，因此，說明復方中黃連、黃柏及連翹的藥物含量對抗炎效果影響較大。

黃連、黃柏、赤芍提取物對金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌具有較強的體外抑菌活性，以中藥方劑3和方劑7的體外抑菌活性最強，且以方劑3對小鼠急、慢性炎癥的抑制效果最好，而單味中藥及其復方的體內抑菌效果及抗炎機制尚需進一步研究。

[1] 金耀忠，萬世平，姜法銘，等．奶牛乳房炎流行情況調查及主要病原分離與藥敏試驗[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2011, 43(5): 64-67.

[2] 楊睿. 重慶部分地區(qū)奶牛乳房炎細菌調查及對溶菌酶敏感性試驗[D].重慶:西南大學, 2008.

[3] 陳松. 奶牛乳房炎病原分析、泌乳兔乳房炎模型建立、公連注射液治療效果研究[D].河北:河北農業(yè)大學,2012.

[4] 張傳梅, 楊海燕, 單虎. 九味中藥及其復方對奶牛乳房炎病原菌的體外抑菌試驗[J].動物醫(yī)學進展, 2012, 33(4):132-134.

[5] 翟蓮, 宋凱凱, 劉瑞錦. 中藥水提液純化研究進展[J]. 齊魯藥事, 2011, 30(5): 296-297.

[6] 華玉鈴, 賀祝英, 張建玲, 等. 中藥軟膏劑制備方法的研究進展[J]. 貴陽中醫(yī)學院學報, 2008, 30(2): 66-68.

[7] 韓志帥, 張鐵, 鐘秀會, 等.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及中藥體外抑菌試驗[C].中國畜牧獸醫(yī)學會—第三屆中國獸醫(yī)臨床大會論文集甘肅, 中獸基技術專題,2012:307-311.

[8] 馮慶彬, 張秀英. 治療奶牛乳腺炎中藥透皮制劑處方的篩選[J]. 東北農業(yè)大學學報,2008,39(9):75-78.

[9] 郝滿良, 白麗欣, 秦建華. 復方黃連乳腺炎注射液的藥理作用與安全性研究[J]. 中國農學通報,2012,28(11):55-60.

[10]宋世秀, 劉明江, 蔣小玉,等. 奶牛乳房炎中獸醫(yī)辨證論治[C].中國畜牧獸醫(yī)學會中獸醫(yī)學分會2013年學術年會論文集, 2013.

[11]李娟, 李曉東, 楊麗霞, 等. 單味中藥體外抑菌活性的研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志,2011,17(11):283-286.

[12]白峰, 王文魁, 王廣彬, 等. 22種中藥對3種奶牛乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗. 中國奶牛. 2010, 2: 39-41

[13]白麗欣, 郝滿良, 葉寶娜, 等. 復方黃連乳腺炎注射液及小檗堿抑菌試驗[J]. 河北農業(yè)大學學報, 2010, 33(2):88-93.

[14]孫茂勇, 董發(fā)明, 張曉鋒. 中藥復方制劑對奶牛隱性乳房炎的影響[J]. 河南畜牧獸醫(yī)：綜合版, 2013, 34(10):8-9.

[15]馬曉輝. 中藥透皮給藥系統的研究進展[J]. 中國實用醫(yī)藥, 2015, 10(2):246-247.

[16]杜瓊. 中藥透皮劑對實驗性和臨床型乳腺炎治療效果研究[D]. 黑龍江:東北農業(yè)大學, 2008.

[17]呂程, 方勤學, 施飛. 氮酮、二甲基亞砜對鹽酸左旋咪唑透皮促滲效果的比較研究[J]. 畜禽業(yè), 2009, 10:30-32.

[18]吳巍, 苗明三. 常用中藥外用劑型的特點及應用[J]. 中醫(yī)學報, 2011, 26(125):108-110.

[19]楊磊, 張延英, 李卉, 等. 黃柏煎劑的抗炎、抗菌作用研究[J]. 實驗動物科學, 2014, 31(4): 14-17.

[20]向楚兵, 倪彩霞, 陳林, 等. 赤芍二基原藥材的抗炎、鎮(zhèn)痛作用比較研究[J]. 中藥與臨床, 2011, 2(1):46-48.

(編 輯：陳希)

Screening of Chinese Medicine Formula and Anti-inflammatory Effects of Chinese Medicine Formula with Antibacterial Activity to Mastitis Pathogens

RONG Xia1,2, WANG Zi-li1,3*, ZHANG Zhu1,TU Jun-ping1,WEI Xue-liang1, JIN Mei-lan1, BIE Ying-tang3, ZHANG Jia-hua1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China; 2.DaxingTownanimalhusbandryandveterinarystationofBishancountyofChongqing404000,China; 3.ChongqingGondaGroupCo.，Ltd.,Chongqing400020,China)

In order to screen of Chinese herb extracts formula with anti-bacterial effects to major mastitis pathogens, then to study its anti-inflammatory effect, the experiment was carried out to learn the Chinese herbs including berberine, cork, red peony, sophora, forsythia designed in different Chinese medicine formulas by orthogonal test, and then to investigate the antibacterial effect of each single herb and their formulas againstStaphylococcusaureus,Streptococcusdysgalactiae,StreptococcusagalactiaeandE.coliinvitroby plate diffusion method, tube dilution method and plate count method. Also the inhibitory effect of different dosage forms of Chinese medicine formulas on xylene-induced ear edema in mice with acute inflammation and cotton induced chronic granulomatous inflammation are studied. The results show that the sensitivity of 4 bacteria to the 5 herbs were successivelyStreptococcusagalactiae,Streptococcusdysgalactiae,StaphylococcusaureusandE.coli, the formula 3 and 7 exhibit with strong antibacterial activity and the formula 3 has a good anti-inflammatory effect to acute and chronic inflammation.

mastitis; Chinese herbal compound; antibacterial; anti-inflammatory

重慶市應用開發(fā)計劃項目(cstc2014yykfB10001)；重慶市博士后特別資助項目(XM20120050)，西南大學2014年學科團隊建設項目(2362014xk18)

榮霞，碩士研究生，從事動物產品檢驗檢疫方面研究。

王自力。E-mail: wzl9698@126.com

2015-07-10

A

1002-1280 (2015) 08-0025-07

S853.76