惠小洋,余群力*,曹暉,韓廣星,吳磊,韓玲
1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070) 2(陜西秦寶牧業(yè)股份有限公司,陜西 寶雞,721000)3(山東綠潤(rùn)食品有限公司,山東 臨沂,276000) 4(河北福成五豐食品股份有限公司,河北 三河,065200)
保水性(water-holding capacity,WHC)是指肉在受到外力作用下保持水分的能力,它可以賦予肉品多汁性和更好的口感。研究表明成熟過(guò)程中WHC的變化與細(xì)胞骨架蛋白有關(guān)[1],肌原纖維蛋白降解導(dǎo)致肌肉蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變化,影響其保留水分的能力,此外蛋白氧化可通過(guò)改變蛋白質(zhì)的靜電效應(yīng)和空間效應(yīng)來(lái)影響肌肉中水分的分布和流動(dòng)。宰后肌肉因缺氧從有氧呼吸轉(zhuǎn)為無(wú)氧酵解,無(wú)氧條件下葡萄糖(glycose,Glc)分解成丙酮酸供能,丙酮酸進(jìn)一步被還原為乳酸(lactic acid,HL),直至酸度過(guò)大、參與的酶類失活,此過(guò)程是宰后肌肉pH下降的主要原因,而宰后pH值的變化速度與幅度會(huì)影響WHC[2]。研究表明冷卻可減緩pH值的下降速率,減少肌球蛋白的變性和汁液流失,對(duì)肌肉的保水性有積極作用[3],且迅速降低肉深層的溫度可在肉的表面形成一層干燥膜,阻止微生物生長(zhǎng)繁殖,減緩內(nèi)部水分蒸發(fā),并抑制酶的活性減緩代謝過(guò)程[4]。
宰后胴體發(fā)生無(wú)氧酵解產(chǎn)生熱量,為腐敗微生物生長(zhǎng)提供條件,同時(shí)高溫會(huì)加速水分散失,易引發(fā)熱收縮導(dǎo)致肉品質(zhì)下降。為在宰后盡快散失胴體熱量,有學(xué)者對(duì)冷卻方式進(jìn)行了研究。常規(guī)冷卻是指將肉置于4 ℃完成排酸的過(guò)程,但存在微生物污染風(fēng)險(xiǎn)且伴隨較大汁液損失,此外考慮到中國(guó)肉牛的體重及背膘厚度,企業(yè)應(yīng)用常規(guī)冷卻可能會(huì)導(dǎo)致冷收縮的發(fā)生[5];延遲冷卻使肉在僵直前期溫度較高,易引起熱收縮降低其保水性[6],同時(shí)胴體干耗和水分蒸發(fā)增加,微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)也更大;三段式冷卻雖表現(xiàn)出更小的汁液損失,但操作較復(fù)雜[7]??焖倮鋮s對(duì)保水性有益的研究已經(jīng)從其他動(dòng)物試驗(yàn)中獲得,豬肉經(jīng)快速冷卻處理后總蛋白和肌漿蛋白溶解性提高,持水性顯著提高[8];山羊經(jīng)快速冷卻處理后肌漿蛋白加速降解,蒸煮損失降低[9]。
因考慮到快速冷卻可能對(duì)牛胴體存在增韌現(xiàn)象,現(xiàn)有研究多集中于如何改善牛肉嫩度,但針對(duì)其保水性影響的研究較少。因此,試驗(yàn)通過(guò)分析糖酵解上下游反應(yīng)產(chǎn)物及骨架蛋白變化情況,研究宰后成熟過(guò)程中,快速冷卻對(duì)牛背最長(zhǎng)肌保水性的影響。
選取商業(yè)飼養(yǎng)場(chǎng)(張掖元博農(nóng)業(yè)有限公司)飼喂批次相同、36~48月齡、體重相近的雜交牛6頭(當(dāng)?shù)攸S?!廖鏖T(mén)塔爾牛,宰前體重(420±20) kg),宰前24 h禁食禁水,按伊斯蘭屠宰方式屠宰。宰后迅速取下其左右側(cè)的背最長(zhǎng)肌(TheM.longissimusdorsi,LD;第12胸椎到第5腰椎),每頭牛取30 g LD在液氮中冷凍作為0 h樣本,所有左側(cè)LD樣本施以快速冷卻處理(rapid chilling,RC;將樣品置于-18 ℃、風(fēng)速2.5 m/s、相對(duì)空氣濕度90%~95%環(huán)境中,當(dāng)其中心溫度降至4 ℃,轉(zhuǎn)移到預(yù)先滅菌的4 ℃冷庫(kù)中冷藏),右側(cè)LD樣本施以常規(guī)冷卻處理(common chilling,CC;將樣品置于4 ℃冷庫(kù)中冷藏),測(cè)定成熟至6、12、24、48、72、120、168 h時(shí)的各項(xiàng)指標(biāo)。
Tris、SDS、哌嗪-N,N′-雙(2-乙磺酸),美國(guó)Sigma公司;肌糖原測(cè)定試劑盒、乳酸測(cè)定試劑盒、葡萄糖測(cè)定試劑盒、6-磷酸葡萄糖測(cè)定試劑盒,南京建成公司;其他試劑均為分析純。
YYW-2型應(yīng)變式控制式無(wú)側(cè)限壓力儀,南京土壤儀器廠有限公司;PHS-3C 型電子pH計(jì),上海日島科學(xué)儀器公司;TGL-24M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;XHF-D高速分散器,寧波新芝生物科技股份有限公司。
1.3.1 pH
將pH計(jì)直接插入背最長(zhǎng)肌肉樣進(jìn)行測(cè)定,每塊肉樣重復(fù)3次,記錄數(shù)據(jù)。
1.3.2 糖酵解潛力(glycolysis potential,GP)
肌糖原、乳酸、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖(6-phosphate glucose,G-6-P)含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果計(jì)算參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,糖酵解潛力GP計(jì)算參照MONIN等[10]如公式(1):
GP/(μmol·g-1)=2×(肌糖原含量+Glc含量+G-6-P含量)+乳酸含量
(1)
1.3.3 持水力
1.3.3.1 加壓損失
采用FAROUK[11]改進(jìn)的加壓濾紙法,截取面積5 cm2、厚度1 cm的肉樣,稱重記為m1,將肉樣置于2層醫(yī)用紗布之間,上下各墊18層濾紙,置于壓縮儀平臺(tái)上,勻速加壓至35 kg,保持5 min,撤除壓力后立即稱重記為m2,每個(gè)處理重復(fù)測(cè)定3次,加壓損失計(jì)算如公式(2):
(2)
1.3.3.2 蒸煮損失
修整去除肉塊表面脂肪和結(jié)締組織,稱重記為m1后裝袋,80 ℃恒溫水浴加熱,用數(shù)顯溫度計(jì)記錄加熱過(guò)程中肉塊的中心溫度,至70 ℃后保持30 min,取出冷卻至室溫,用吸水紙吸干肉塊表面汁液,稱重記為m2,蒸煮損失[12]計(jì)算如公式(3):
(3)
1.3.3.3 滴水損失
取每頭牛LD樣本適量,稱重記為m1后用S型鉤鉤住其一端,放入包裝后充氣密封,將肉塊懸掛在其中,確保肉塊四周不與包裝袋接觸,4 ℃下吊掛24 h后,打開(kāi)包裝用濾紙擦干肉樣表面水分,再次稱重記為m2。滴水損失[12]計(jì)算如公式(4):
(4)
1.3.4 肌原纖維蛋白性質(zhì)
1.3.4.1 肌原纖維蛋白提取
參考XIONG等[13]的方法得到肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP),采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
1.3.4.2 表面疏水性
參照CHELH等[14]的方法并稍作修改。將80 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液懸入2 mL 1 mg/mL MP蛋白溶液,渦旋振蕩10 min,離心(4 ℃,4 000×g,15 min),取上清液稀釋10倍后測(cè)定595 nm處吸光值,以2 mL提取緩沖液加入80 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液為空白對(duì)照。表面疏水性(surface hydrophobicity,S0,μg)計(jì)算按公式(5):
(5)
1.3.4.3 熱聚合效應(yīng)分析
參考XIA等[15]的方法,用15 mmol/L哌嗪-N,N′-雙(2-乙磺酸)磷酸鉀緩沖液(pH 6.0,離子強(qiáng)度0.6 mol/L)將MP蛋白液濃度調(diào)為1 mg/mL,并于熱水浴中加熱,600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定加熱過(guò)程中(30、40、50、60、70、80 ℃)蛋白吸光度。
綜上所述,乳腺腫塊超聲診斷時(shí)綜合二維聲像與彩色多普勒檢查,可進(jìn)一步明確診斷患者疾病,用于指導(dǎo)臨床治療。
1.3.4.4 乳化性
參照AGYARE等[16]的方法并作適當(dāng)修改,將20 mL 1 mg/mL的MP蛋白溶液懸在5 mL大豆油中,高速勻漿(10 000 r/min,1 min,0~4 ℃),立即從管底0.5 cm地方采取乳濁液50 μL,加入到5 mL 0.1% SDS溶液中振蕩混勻,靜置10 min,測(cè)定500 nm處吸光值(A0),重復(fù)以上操作,再次測(cè)定吸光值(A10),0.1% SDS溶液作為空白對(duì)照,計(jì)算乳化活性指數(shù)(emulsifying activity index,EAI)和乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability index,ES)如公式(6)、(7):
(6)
(7)
式中:A500,500 nm波長(zhǎng)處吸光值;φ,油相體積分?jǐn)?shù)(油的體積/乳濁液的體積);ρ,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,g/mL;A0,A10,乳濁液在0,10 min的吸光值。
1.3.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析
試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0(SPSS Inc.,Chicago,IL)軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析、Duncan顯著性檢驗(yàn)及Pearson相關(guān)性分析。
屠宰后動(dòng)物體內(nèi)積累的肌糖原開(kāi)始分解產(chǎn)生乳酸,引起肌肉酸度值升高表現(xiàn)為pH下降。pH下降,肌肉環(huán)境中負(fù)電荷增加中和了蛋白質(zhì)中的部分正電荷,從而減弱了蛋白質(zhì)之間的靜電斥力使蛋白纖絲間空隙減小,保水性下降[17]。實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)CC處理牛肉在宰后72 h達(dá)到pHu,之后開(kāi)始解僵。在宰后12 h內(nèi),RC組pH下降速率較慢,由于低溫可抑制牛肉內(nèi)源酶的活性從而減緩代謝速率,對(duì)宰后初期肌肉pH的下降速率有一定的影響。RC組比CC組較早到達(dá)pHu,可能是因?yàn)樵缀笤缙诘蜏靥幚硪疠^高pH,鈣蛋白酶體系在高pH環(huán)境下活性更高,有利于其降解肌肉蛋白以獲得更好的嫩度,同時(shí)抑制僵直對(duì)肉質(zhì)產(chǎn)生的不利影響,從而縮短僵直期。
圖1 冷卻方式對(duì)成熟過(guò)程中牛肉pH的影響Fig.1 The effect of chilling methods on the aging process on pH of beef注:圖中所標(biāo)不同字母者時(shí)間點(diǎn)之間差異極顯著(p<0.01);標(biāo)*者冷卻方式之間差異顯著(p<0.05);**者差異極顯著(p<0.01)。下同。
糖酵解潛力(glycolytic potential,GP)是宰后可轉(zhuǎn)化成乳酸等各類化合物的糖類化合物數(shù)量總和的較理想近似值[10]。由圖2-a可知RC組肌糖原含量在宰后48 h降至2.55 mg/g,2種冷卻方式下的肌糖原含量在宰后6、24、48、72 h差異極顯著。由圖2-b可知RC組Glc含量在宰后48 h達(dá)到峰值9.79 mmol/L。由圖2-c可知宰后72 h CC組HL含量達(dá)峰值214.67 μmol/g,48 h RC組峰值214.33 μmol/g,2種冷卻方式下HL含量在宰后24、48、72 h差異顯著。
圖2 冷卻方式對(duì)成熟過(guò)程中牛肉糖酵解潛力的影響Fig.2 The effect of chilling methods on the aging process on glycolysis potential of beef
由圖2-d可知成熟過(guò)程中GP先升后降,RC組宰后48 h出現(xiàn)了峰值297.45 μmol/g。RC組GP各指標(biāo)在宰后6 h內(nèi)變化趨勢(shì)均較平緩,且出現(xiàn)極值的時(shí)間早于CC組。
CC組宰后6 h內(nèi)快速糖酵解產(chǎn)生大量熱能,除了使胴體溫度處于較高水平外,還使肌肉pH迅速降低,高溫和低pH在宰后初期易引發(fā)蛋白變性,降低肌肉保水性。RC組宰后12 h內(nèi)肌糖元消耗緩慢,低溫抑制肌糖原向下游物質(zhì)轉(zhuǎn)化。RC組通過(guò)低溫處理控制了糖酵解速率,從而降低了劣質(zhì)肉發(fā)生概率,這與RYU等的研究相似[18]。宰后機(jī)體不再產(chǎn)生新的能量源,肌糖原不斷被消耗,因此成熟后期肌糖元含量在較低水平趨于穩(wěn)定[19]。肌肉中Glc含量在宰后僵直最大期附近出現(xiàn)峰值,該階段糖原通過(guò)酵解代謝轉(zhuǎn)化為充足的Glc,同時(shí)未及時(shí)向下游HL進(jìn)行轉(zhuǎn)化,無(wú)氧酵解所需的酶因HL在胞內(nèi)聚集pH降低導(dǎo)致LDH失活,此時(shí)肌糖原不會(huì)再分解,糖酵解下游反應(yīng)被抑制。RC組通過(guò)低溫控制糖酵解反應(yīng)速率,避免過(guò)快產(chǎn)生大量Glc,使Glc處于較低水平。HL含量屠宰后期下降,這是由于其他微生物的活動(dòng)消耗HL,表觀上pH出現(xiàn)一定幅度的上升,這與HOVENIER等的研究結(jié)果相一致[20]。
宰后12 h內(nèi)RC組糖酵解潛力變化速率受到抑制。隨著無(wú)氧酵解的進(jìn)行,胴體內(nèi)積累的糖原消耗速率放緩,糖酵解潛力逐漸下降。隨著僵直的進(jìn)行,RC組無(wú)氧快速酵解的特性表現(xiàn)得更加明顯,趨于更早到達(dá)僵直最大階段,且主要影響肉質(zhì)的肌糖原和HL含量隨著成熟的進(jìn)行變化逐漸平穩(wěn)。因?yàn)槊富钚詮?qiáng)烈依賴于溫度,降低冷卻溫度具有降低糖酵解速率的效果[10]。
圖3-a中RC組宰后48 h達(dá)到加壓損失最大值35.09%。2種冷卻方式對(duì)加壓損失的影響在168 h內(nèi)均顯著。圖3-b反映出RC組的滴水損失在宰后24 h至168 h間上升平緩。圖3-c可見(jiàn)宰后初期蒸煮損失上升,CC組宰后72 h蒸煮損失為45.94%,RC組48 h為43.09%,此后水分損失上升的趨勢(shì)被抑制。2種冷卻方式對(duì)比下,除120 h差異不顯著外,其余組均呈現(xiàn)出顯著差異。實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)冷卻處理的牛肉在宰后24、72 h時(shí)間點(diǎn)前后有明顯的質(zhì)量變化。
圖3 冷卻方式對(duì)成熟過(guò)程中牛肉持水力的影響Fig.3 The effect of chilling methods on the aging process on WHC of beef
宰后初期肌肉保水性的下降主要與肌纖維在僵直期間的收縮有關(guān),成熟過(guò)程中肌纖維蛋白降解使肌纖維膨脹并減弱了細(xì)胞向外的延伸能力,從而保持住了水分。宰后pH下降引起肌動(dòng)球蛋白形成,導(dǎo)致蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙減小,迫使內(nèi)部的水分滲出。有研究表明,宰后初期pH下降速率是影響加壓損失的決定因素[21];本實(shí)驗(yàn)RC組加壓損失較低,這與低溫抑制糖酵解酶活使宰后初期pH下降速率緩慢有關(guān)。滴水損失的增加在屠宰后期變緩,原因可能是成熟過(guò)程中肌肉骨架蛋白結(jié)構(gòu)被破壞,蛋白質(zhì)變性,結(jié)合水能力降低。RC組屠宰24h后滴水損失變化平穩(wěn)且低于CC組,由于宰后低溫處理樣本1 h會(huì)使其表面硬化甚至形成冰膜,從而降低胴體表面水分蒸發(fā)速率。蒸煮損失的變化主要取決于胴體pHu的差異[22]。RC組宰后初期對(duì)溫度的控制直接影響pHu,使其高于CC組,從而降低了成熟后期的蒸煮損失。宰后48 h內(nèi)RC組蒸煮損失始終較高且冷卻方式間差異極顯著,這可能是因?yàn)樵缀? h樣本中心溫度更低使肉中生成小的結(jié)晶體[23],熱處理會(huì)使溫度對(duì)樣本的影響加劇,從而影響蒸煮損失。
S0是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)水合情況的重要特性。由圖4可以看出成熟過(guò)程中結(jié)合BPB含量呈先升后降趨勢(shì),宰后24 h內(nèi)RC組S0增長(zhǎng)緩慢且低于CC組,2種冷卻方式在宰后12 h有顯著性差異。結(jié)合BPB含量CC組在宰后72 h達(dá)到峰值24.45 μg,RC組48 h升至峰值21.81 μg并始終低于CC組。宰后120 h后2種冷卻方式結(jié)合BPB含量均趨于穩(wěn)定。
圖4 冷卻方式對(duì)成熟過(guò)程中牛肉蛋白質(zhì)S0的影響Fig.4 The effect of chilling methods on the aging process on protein surface hydrophobicity of beef
S0越高結(jié)合水的能力越弱。屠宰初期S0一定程度上升,時(shí)間作用下蛋白質(zhì)輕微氧化,疏水基團(tuán)逐漸暴露于蛋白質(zhì)的表面,引起蛋白質(zhì)保水性下降[24]。屠宰后期S0下降可能是因?yàn)槌墒鞂?dǎo)致肌纖維蛋白降解成更小片段,因此蛋白片段所帶電荷數(shù)增多,親水能力加強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RC組與CC組相比結(jié)合BPB含量更低,這可能是因?yàn)榈蜏乜梢杂行б种埔颦h(huán)境溫度較高引起的肉中蛋白質(zhì)變性[17]。
如圖5所示牛肉MP溶液濁度隨加熱溫度升高而升高,隨成熟的進(jìn)行有先升后降的變化。
圖5 冷卻方式對(duì)成熟過(guò)程中牛肉MP熱聚合效應(yīng)的影響Fig. 5 The effect of chilling methods on the aging process on MP thermal polymerization effect of beef
加熱過(guò)程中CC組蛋白溶液濁度均高于RC組。蛋白交聯(lián)程度CC組宰后72 h最大,RC組宰后48 h最大。加熱至80 ℃,RC組MP溶液濁度宰后48 h到達(dá)峰值0.7。
熱聚合效應(yīng)反映肉品加工過(guò)程中蛋白質(zhì)變化情況。本實(shí)驗(yàn)中MP溶液在加熱過(guò)程中濁度逐漸增加,加熱使蛋白質(zhì)發(fā)生相互交聯(lián)導(dǎo)致溶液光學(xué)密度增加,濁度越大蛋白交聯(lián)程度越大。因此CC組MP溶液分子間的交聯(lián)作用強(qiáng)于RC組,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與XIA等結(jié)果相似[25]。蛋白質(zhì)分子之間的相互交聯(lián)作用加強(qiáng)將會(huì)導(dǎo)致一些其他的活性基團(tuán)與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用減弱,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)一些功能特性如保水性的下降[26],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RC處理削弱了這種不利影響。
如圖6所示,成熟過(guò)程中不同冷卻方式下樣本MP溶液的乳化性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),宰后初期RC組乳化水平變化幅度較小。RC組EAI宰后48 h顯著降至最小值36.29 m2/g,宰后72 h至168 h RC組EAI均高于CC組。ES表現(xiàn)出與EAI類似的變化趨勢(shì),2種冷卻方式對(duì)比,除12 h外ES均差異顯著。CC組ESI宰后48 h降至最小值13.74%,RC組ES宰后24 h降至最低值16.82%。
圖6 冷卻方式對(duì)成熟過(guò)程中牛肉MP乳化性的影響Fig.6 The effect of chilling methods on the aging process on MP emulsifying properties of beef
實(shí)驗(yàn)表明,成熟過(guò)程中樣本MP的EAI和ES先下降后上升。當(dāng)pH達(dá)到極限值時(shí)接近肌原纖維蛋白等電點(diǎn),此時(shí)蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在,所帶的凈電荷最少,分子間作用力減弱,此時(shí)吸附在油水界面蛋白質(zhì)分子也最少,導(dǎo)致EAI較低。之后隨pH的上升,電荷的靜電斥力增加,蛋白質(zhì)分子分散開(kāi),表面張力降低,疏水性基團(tuán)暴露在外,保水性下降。在吸附脂肪粒的過(guò)程中,蛋白質(zhì)骨架上的疏水殘基定向移動(dòng)到油滴表面,發(fā)生構(gòu)象重排[27],有利于體系乳化的進(jìn)行,乳化性升高。RC組表現(xiàn)出更好的親水性可能是因?yàn)闇囟扔绊懙鞍踪|(zhì)降解,形成的乳化液液滴的尺寸較小,粒子不易聚集,乳液的穩(wěn)定性較高[28]。
如表1所示,CC組與RC組相關(guān)性系數(shù)比較后發(fā)現(xiàn),三大表觀持水力與GP、乳化性、S0均呈現(xiàn)顯著或極顯著相關(guān)性,選取用于分析保水性的指標(biāo)科學(xué)合理。值得關(guān)注的是RC組pH與其余指標(biāo)的相關(guān)程度極高,再次證明溫度作用下宰后肉的內(nèi)環(huán)境中正負(fù)電荷平衡程度變化劇烈,并以此影響肉質(zhì)及保水性。糖酵解過(guò)程對(duì)pH的作用與能量代謝密不可分。無(wú)論CC組、RC組均可見(jiàn)保水性與S0、GP和乳化性的關(guān)聯(lián)性與成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)變化緊密相關(guān),通過(guò)引發(fā)肌動(dòng)球蛋白的形成使其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔隙減小、或暴露疏水基團(tuán)降低保水性,以及蛋白降解使肌細(xì)胞膨脹從而提高保水性。
(1)快速冷卻處理顯著提升了成熟后期牛背最長(zhǎng)肌的表觀持水力。
(2)快速冷卻處理影響了宰后初期蛋白質(zhì)性質(zhì)的變化及糖酵解上下游產(chǎn)物的生成。
(3)快速冷卻處理有利于加速完成肉品成熟,消減僵直引發(fā)的不良影響。
(4)快速冷卻條件下完成成熟的牛肉,在熱作用下具有更好的保水性,對(duì)肉品加工有積極作用。