熒光假單胞菌對采后錦橙青霉病的防治和貯藏品質(zhì)的影響

王智榮，江孟遙，杜木英, 2, 3，汪開拓，Zsolt Zalán，F(xiàn)erenc Hegyi，闞建全, 2, 3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(中匈食品科學(xué)聯(lián)合研究中心，重慶，400715)3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶，400715)4(重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶，404100)5(匈牙利國家農(nóng)業(yè)研究和創(chuàng)新中心食品科學(xué)研究所，匈牙利布達(dá)佩斯，H-1022)

錦橙(CitrussinensisOsbeck，Jincheng)，又名鵝蛋柑、中農(nóng)1號、S26，果形美觀，細(xì)嫩無渣，酸甜可口，品質(zhì)上佳，是重慶乃至全世界主要的優(yōu)良柑橘品種之一[1]。但錦橙在貯運(yùn)期間極易受到意大利青霉(Penicilliumitalicum)的侵染而發(fā)生嚴(yán)重的青霉病，造成巨大的商業(yè)損失和資源浪費(fèi)[2-3]。傳統(tǒng)控制采后果蔬病原菌侵染主要依賴于化學(xué)殺菌劑，但隨著近年來消費(fèi)者對化學(xué)殘留、環(huán)境污染、病原菌抗性出現(xiàn)和增強(qiáng)及對食品安全的日益關(guān)注，利用微生物之間的拮抗作用，選用對宿主沒有負(fù)面作用而能明顯抑制病原菌生長繁殖的拮抗微生物或其代謝產(chǎn)物，越來越受到各國研究者的重視和青睞[4-8]。

熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)是從小麥、水稻、番茄、草莓等作物根際土壤中分離到的拮抗細(xì)菌。研究證實(shí)，P.fluorescens可以顯著抑制番茄、甜瓜、蘋果、柑橘等多種果實(shí)采后腐爛的發(fā)生[9-14]，如WALLACE等[12]研究發(fā)現(xiàn)，P.fluorescens1-112、2-28、4-6能抑制擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長，從而有效防治采后蘋果青霉??；ZAMANI等[14]研究結(jié)果表明，Pseudomonasspp.能抑制指狀青霉的生長繁殖，并能和碳酸氫鈉協(xié)同作用，控制采后柑橘綠霉病。

不同拮抗菌株的抑菌機(jī)理并不完全相同，其抑菌譜也各不相同，對某種特定病原菌的抑制效果也有很大差異。而有關(guān)P.fluorescens對采后柑橘果實(shí)采后青霉病及品質(zhì)的影響尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以錦橙“北碚447”為試材，主要研究了P.fluorescens對采后錦橙采后青霉病的防治作用，并檢測了P.fluorescens菌懸液保鮮處理對采后錦橙自然腐敗、貯藏品質(zhì)及感官品質(zhì)的影響，以期為P.fluorescens在錦橙果實(shí)貯藏保鮮中的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種、試劑和儀器

錦橙北碚447((CitrussinensisOsbeck，Jinchengbeibei 447))，達(dá)到商業(yè)成熟度以后采摘自重慶北碚歇馬的有機(jī)果園。采后4 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過程中盡可能避免損傷。攤開自然風(fēng)預(yù)冷后，挑選飽滿圓潤、大小相似、無病蟲害、無機(jī)械傷的果實(shí)，隨機(jī)分組。

熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，由匈牙利Dr. Zsolt Zalán研究員惠贈(zèng)。意大利青霉(Penicilliumitalicum)，由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院惠贈(zèng)。

吐溫80、2,6-二氯酚靛酚鈉(均為分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；蔗糖、葡萄糖、果糖(均為分析對照品，純度≥98%)，北京索萊寶科技有限公司；乙腈(色譜純)，美國spectrum公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司；抑霉唑(水乳劑，有效成分含量20%)，一帆生物科技集團(tuán)有限公司。

WZT-1M型細(xì)菌濁度儀，上海勁佳科學(xué)儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌各種處理液和病原霉菌孢子懸浮液的制備

拮抗菌的活化[15]：移取10 mL營養(yǎng)肉湯(nutrient broth，NB)于三角瓶中，高溫高壓滅菌，冷卻至室溫；向裝有拮抗菌干粉的安瓿瓶中加入0.5 mL無菌培養(yǎng)液，輕輕吹吸，活化整個(gè)凍干粉顆粒，而后將水化菌液轉(zhuǎn)回三角瓶中，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18～24 h后，移取2 mL于100 mL培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)16～24 h，即為拮抗菌培養(yǎng)液。

拮抗菌各種處理液制備[16]：(1)濾液：將培養(yǎng)液移入無菌離心管中，6 000 r/min，離心10 min，取上清液，用0.22 μm聚碳酸酯膜過濾；(2)原液：移取拮抗菌培養(yǎng)液，以NB為參照，用細(xì)菌濁度儀測定菌液濁度，并用濾液調(diào)節(jié)濃度至1×108CFU/mL，待用；(3)熱殺死液：原液在121 ℃下高壓滅菌20 min；(4)菌懸液：將培養(yǎng)液移入無菌離心管中，6 000 r/min，離心10 min，倒去上清，收集菌體，用無菌水洗滌菌體2次，最后加入無菌水，調(diào)節(jié)至所需濃度，待用；(5)無菌水：蒸餾水在121℃下高壓滅菌20 min。

病原菌孢子懸浮液制備[15-16]：用接種環(huán)將在馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)7 d的病原霉菌刮下，轉(zhuǎn)入含有0.05%吐溫80的無菌水中，攪打均勻后經(jīng)4層無菌紗布過濾，除去菌絲，渦旋振蕩，使其分散均勻。而后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并稀釋至所需濃度，待用。

1.2.2 熒光假單胞菌對意大利青霉的拮抗效果

1.2.2.1 平板抑菌試驗(yàn)

中心混合培養(yǎng)[17]：將PDB(配方同PDA但不加瓊脂)和NB以1∶1比例混合，加入瓊脂粉制成混合固體培養(yǎng)基，正中央打洞，同時(shí)接入20 μL拮抗菌各種處理液和1×106spores/mL病原菌孢子懸浮液，以無菌水為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。

平板對峙培養(yǎng)[18-19]：將PDB和NB以1∶1比例混合，加入瓊脂粉制成混合固體培養(yǎng)基，正中央打洞，接入20 μL 1×106spores/mL病原菌孢子懸浮液，距離平板中心25 mm處對稱劃線(約30 mm)，接種拮抗菌各種處理液，以無菌水為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。

均采用十字交叉法測定病斑直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.2.2 熒光假單胞菌對意大利青霉孢子出芽情況的影響

參照WALLACE等[12]和WANG等[16]的方法并作適當(dāng)修改，在裝有14 mL PDB的試管中加入4 mL 5×106spores/mL病原霉菌孢子懸浮液，再接入2 mL不同濃度的拮抗菌菌懸液。28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔4 h觀察1次孢子的出芽情況，當(dāng)芽管長度大于或等于孢子直徑時(shí)，認(rèn)為孢子萌發(fā)，測定并計(jì)算病原菌孢子的出芽率和芽管長度。

1.2.2.3 拮抗菌各種處理液對采后錦橙青霉病的抑制效果

用滅菌接種針在果實(shí)赤道四側(cè)各刺1個(gè)5 mm(寬)× 4 mm(深)的孔，先分別接種20 μL拮抗菌各種處理液，2 h后接種同等體積的1×104spores/mL病原菌孢子懸浮液，以無菌水作對照，逐果袋封，20 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)。培養(yǎng)8 d后，測定果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑。

1.2.2.4 不同濃度拮抗菌菌懸液對采后錦橙青霉病的抑制效果

果實(shí)打洞后，先分別接種20 μL不同濃度的拮抗菌菌懸液，2 h后接種20 μL 1×104spores/mL病原菌孢子懸浮液，以無菌水和農(nóng)藥抑霉唑(1 000倍稀釋液，商業(yè)建議用量)作對照，逐果袋封，20 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)。培養(yǎng)8 d后，測定果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑。

1.2.2.5 拮抗菌在果實(shí)傷口處的生長動(dòng)態(tài)

果實(shí)打洞后，先接種20 μL 1×108CFU/mL拮抗菌菌懸液，2 h后，再接種相同體積的1×104spores/mL病原菌孢子懸浮液，以無菌水作對照，逐果袋封。分別貯藏于4 ℃和20 ℃，每隔一段時(shí)間取樣測定傷口表面的拮抗菌數(shù)。

果實(shí)傷口處的拮抗菌數(shù)測定方法[20]：在超凈工作臺上用無菌打孔器剜下傷口，放入無菌研缽中，加入100 mL無菌水，仔細(xì)研磨，隨后梯度稀釋，移取100 μL于NA(NB中加入瓊脂)平板上涂布均勻，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，取出，數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算水果傷口的拮抗菌數(shù)。

1.2.2.6 不同處理對錦橙病程相關(guān)蛋白活性的影響

果實(shí)打洞后，先接種20 μL拮抗菌菌懸液，2 h后再分別接種相同體積的無菌水、1×104spores/mL病原菌孢子懸浮液，并以無菌水作對照，逐果袋封，20 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)。處理完成2 h后第1次取樣(0 d)，以后每隔2 d取病斑與完好果皮的交界處，測定幾丁質(zhì)酶(chitinase，CHI)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase，GLU)活性。

CHI和GLU活性測定參照ABELES等[21]的方法并作適當(dāng)修改，CHI以每分鐘分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μgN-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活性單位(U)；GLU以每秒鐘分解昆布多糖產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活性單位(U)。結(jié)果均以U/mg protein表示。

1.2.3 拮抗菌對采后錦橙自然腐敗和貯藏品質(zhì)的影響

果實(shí)除去田間熱后，分別用無菌水、1×108CFU/mL拮抗菌菌懸液和抑霉唑(1 000倍稀釋液，商業(yè)建議用量)浸泡2 min，自然晾干后，逐果袋封，室溫(20±2)℃貯藏60 d后,測定果實(shí)的腐爛率(當(dāng)肉眼可見病變或腐爛超過整個(gè)果實(shí)的30%即認(rèn)為該果實(shí)腐爛[22])，計(jì)算病情指數(shù)，并隨機(jī)挑選完好的果實(shí)進(jìn)行相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)測定和感官評價(jià)。

病情指數(shù)測定參照HOFMAN等[23]的方法，按病斑面積(V)進(jìn)行分級，計(jì)算方法為：病情指數(shù)=Σ(病害級別×該級別果數(shù)占總果實(shí)數(shù)的百分比)

1.2.3.1 指標(biāo)測定

硬度：果實(shí)赤道部位均勻選取4點(diǎn)，采用TA-XI2i質(zhì)構(gòu)儀測定。選用3.8 mm探頭，預(yù)壓速度2.00 mm/s，下壓速度1.00 mm/s，壓入深度為8 mm，以4點(diǎn)的平均值記為該果實(shí)硬度，單位為N。

可溶性固形物(total soluble solid，TSS)：采用手持式糖度計(jì)測定。

含水率、抗壞血酸含量等指標(biāo)均參照曹建康等[24]的方法。

可滴定酸(titratable acid，TA)：采用NaOH滴定法測定[24-25]，以酚酞為指示劑，滴定至微紅色30 s不褪色，結(jié)果以檸檬酸百分?jǐn)?shù)來表示。

蔗糖、葡萄糖、果糖含量：采用高效液相色譜法[26]測定。色譜柱：氨基色譜柱(250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)=70∶30，流速：1.0 mL/min，柱溫：40 ℃，所有樣品均取20 μL自動(dòng)進(jìn)樣。

pH：準(zhǔn)確稱取果實(shí)組織10 g，充分研磨，轉(zhuǎn)入容量瓶，定容至100 mL，搖勻，靜置30 min，取上清液測定pH值。

1.2.3.2 拮抗菌對采后錦橙感官品質(zhì)的影響

參考王圣通[27]和曹琦[28]的方法并作適當(dāng)修改。評價(jià)指標(biāo)包括果實(shí)的硬度、色澤、香氣、滋味和綜合評價(jià)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，用Tukey多重比較方法進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 平板抑菌試驗(yàn)

由表1可知，在1/2 PDA/NA培養(yǎng)基上，P.fluorescens各種處理液都對P.italicum有顯著的抑制作用，熱殺死液和濾液的抑菌效果相近，和對照相比，具有顯著差異，但作用效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于菌懸液和原液；菌懸液和原液之間沒有顯著差異，都具有極好的抑菌效果，中心混合培養(yǎng)時(shí)，能完全抑制P.italicum的生長繁殖，對峙培養(yǎng)時(shí)，對P.italicum的抑制作用分別高達(dá)(52.59±1.59)%和(55.10±1.50)%。

表1 熒光假單胞菌對意大利青霉在混合固體培養(yǎng)基上的抑制效果Table 1 The inhibitory effects of Pseudomonas fluorescens on Penicillium italicum on mixed solid medium

注：同一列內(nèi)不同字母表示差異顯著，字母相同則代表差異不顯著。下表同。

2.2 熒光假單胞菌對病原菌孢子出芽情況的影響

從表2可以看出，P.fluorescens各種處理液都能顯著抑制孢子的萌發(fā)和芽管長度的伸長。對P.italicum孢子發(fā)芽率的作用效果，熱殺死液和濾液之間沒有顯著差異，且其抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于菌懸液和原液；濃度對P.fluorescens菌懸液的抑菌效果具有顯著影響，菌懸液濃度越高，P.italicum的孢子發(fā)芽率越低，芽管長度也越小，當(dāng)菌懸液終濃度為1×108CFU/mL時(shí)，P.italicum的孢子發(fā)芽率僅為(0.67±0.47)%，芽管長度僅為(2.25±0.25)μm，遠(yuǎn)低于對照[分別為(81.55±2.97)%和(43.10±4.03)μm]。

表2 熒光假單胞菌各種處理液對意大利青霉孢子在PDB培養(yǎng)基中出芽情況的影響Table 2 The effects of various treatments of Pseud-omonas fluorescens on conidial germination ofPenicillium italicum in PDB

2.3 熒光假單胞菌各種處理液對采后錦橙青霉病的抑制效果

從圖1可以看出，P.fluorescens菌懸液(1×108CFU/mL)對采后錦橙青霉病的抑制效果最好，貯藏8 d后，果實(shí)的發(fā)病率僅為(56.67±2.36)%，病斑直徑僅為(2.79±0.18)cm；原液對錦橙青霉病也有較好的抑制作用，但其抑菌效果較同等濃度的菌懸液低；和對照相比，經(jīng)濾液和熱殺死液處理的錦橙，和對照相比，其發(fā)病率和病斑直徑具有顯著差異，但抑菌作用不明顯。

圖1 熒光假單胞菌各種處理液對采后錦橙青霉病的抑制效果Fig.1 The inhibitory effects of various treatments ofP. fluorescens on blue mold on Jincheng orange

2.4 不同濃度熒光假單胞菌菌懸液對采后錦橙青霉病的抑制效果

由圖2可知，P.fluorescens菌懸液對采后錦橙青霉病具有顯著抑制作用，有效減緩了采后錦橙的病害進(jìn)程。雖然P.fluorescens的作用效果明顯弱于農(nóng)藥抑霉唑，但經(jīng)P.fluorescens菌懸液處理后的錦橙，其發(fā)病率和病斑直徑顯著低于對照。濃度對P.fluorescens的抑菌作用具有顯著影響，當(dāng)菌懸液濃度為1×109CFU/mL時(shí)，青霉病發(fā)病率和病斑直徑僅為(49.17±1.18)%和(2.72±0.09)cm，遠(yuǎn)低于對照[(95.83±3.12)%和(3.80±0.31)cm]。

Ⅰ-無菌水；Ⅱ-1×106 CFU/mL；Ⅲ-1×107 CFU/mL；Ⅳ-1×108 CFU/mL；Ⅴ-1×109 CFU/mL；Ⅵ-抑霉唑圖2 不同濃度熒光假單胞菌菌懸液對采后錦橙青霉病的抑制效果Fig.2 The inhibitory effects of P. fluorescens suspension with different concentrations on blue mold disease of Jincheng orange

2.5 熒光假單胞菌在果實(shí)傷口處的動(dòng)態(tài)生長

從圖3可以看出，不論是低溫冷藏還是室溫貯藏，P.fluorescens都能在果實(shí)傷口處快速生長繁殖。接種P.fluorescens+無菌水2 h(0 d)后，果實(shí)傷口處的拮抗菌數(shù)僅為1.44×104CFU/傷口，4 ℃下培養(yǎng)16 d，拮抗菌數(shù)增加至4.84×105CFU/傷口；20 ℃培養(yǎng)8 d后，增加至4.05×105CFU/傷口；和對照相比，P.italicum能有效降低P.fluorescens的增長速率。經(jīng)擬合，接種P.fluorescens+無菌水處理組傷口處的拮抗菌數(shù)(Y)與培養(yǎng)時(shí)間(X)的關(guān)系(4 ℃下)：lgY=-0.002 6X2+0.129 9X+4.216，R2=0.974 7，20 ℃條件下為：logY=-0.019 7X2+0.331X+4.198 3，R2=0.984 2；接種P.fluorescens+P.italicum處理組傷口處的拮抗菌數(shù)(Y)與培養(yǎng)時(shí)間(X)的關(guān)系(4 ℃下)：logY=-0.003 2X2+0.135 9X+3.951 6，R2=0.983 7，20 ℃為：logY=-0.005 5X2+0.176 2X+4.067 1，R2=0.938 7。

圖3 4 ℃(A)和20 ℃(B)下熒光假單胞菌在果實(shí)傷口處的動(dòng)態(tài)生長Fig.3 Dynamic growth of P. fluorescens at fruit wound at 4 ℃ (A) and 20 ℃ (B)

2.6 熒光假單胞菌對錦橙病程相關(guān)蛋白活性的影響

由圖4可知，各處理組的CHI活性都呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，基本都在第2天到達(dá)高峰，而接種P.fluorescens處理組CHI活性繼續(xù)上升，于第4天達(dá)到最高，之后急劇下降，整個(gè)貯藏期間，和對照相比，各處理都能誘導(dǎo)果實(shí)CHI活性的上升。

圖4 不同處理下錦橙果皮CHI(A)和GLU(B)活性的變化Fig.4 The changes of CHI (A) and GLU (B) activities in Jincheng orange peel under different treatments

果皮中GLU活性的變化和CHI類似，大體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，前期P.fluorescens對GLU具有極強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，但隨著病害的加深，誘導(dǎo)作用變?nèi)?，單?dú)接種P.fluorescens和接種P.fluorescens+病原菌處理組分別在第2天和第4天GLU活性達(dá)到高峰，此后GLU活性逐漸下降。

2.7 熒光假單胞菌對采后錦橙自然腐敗的影響

圖5表明，農(nóng)藥抑霉唑的保鮮效果最好，經(jīng)抑霉唑處理的果實(shí)，其腐爛率和病情指數(shù)都最??；和對照相比，P.fluorescens能降低采后錦橙的腐爛率，然而在數(shù)理統(tǒng)計(jì)上沒有顯著差異，但對病情指數(shù)的影響差異顯著。

圖5 熒光假單胞菌對錦橙自然腐敗的影響Fig.5 The effects of P. fluorescens on natural decay of Jincheng orange

2.8 熒光假單胞菌對采后錦橙貯藏品質(zhì)的影響

由表3可知，貯藏后，果皮的硬度略有上升，含水率明顯下降，各種處理對果實(shí)的硬度影響沒有顯著差異，但對含水率的影響差異顯著；貯藏后，果皮中的可滴定酸含量上升，這也和pH值的變化趨勢一致，P.fluorescens菌懸液處理和對照之間沒有顯著差異，但抑霉唑能顯著抑制可滴定酸含量的上升。

表3 熒光假單胞菌對采后錦橙貯藏品質(zhì)的影響(果皮)Table 3 The effects of P. fluorescens onstorage quality of Jincheng orange (peel)

由表4可知，錦橙室溫貯藏60 d后，TSS、抗壞血酸含量明顯上升，TA含量有所下降，由于果皮的保護(hù)作用和整個(gè)果實(shí)的失重，貯藏后果肉的含水率反而略微上升。和對照相比，各處理對錦橙TSS、果糖含量沒有顯著影響，但會(huì)顯著抑制TA含量的下降和抗壞血酸、葡萄糖含量的上升；P.fluorescens菌懸液處理導(dǎo)致果肉蔗糖含量顯著上升，而抑霉唑則會(huì)導(dǎo)致葡萄糖含量下降，蔗糖含量上升。

2.9 熒光假單胞菌對采后錦橙感官品質(zhì)的影響

從圖6可以看出，貯藏后的感官硬度明顯下降，其中尤以無菌水處理組感官硬度得分最低；由于果實(shí)失水、失重，導(dǎo)致果皮變得皺縮、干枯，不再飽滿圓潤，因而貯藏后果實(shí)的色澤感官得分較低，而各處理之間的色澤得分差異不大；貯藏后，果實(shí)的香氣得分明顯降低，和對照相比，菌懸液和抑霉唑處理會(huì)顯著削弱果實(shí)的香氣，尤其是抑霉唑處理組，在感官評價(jià)過程中，有個(gè)別感官評價(jià)員甚至聞到了殘留的農(nóng)藥味；貯藏后的感官滋味得分顯著上升，各處理對滋味的感官影響差異顯著，對照得分最高，其次是菌懸液處理組，抑霉唑處理組得分最低；除抑霉唑處理組綜合評價(jià)得分偏低外，其余各組得分相差不大；貯藏后，各項(xiàng)感官指標(biāo)的得分之和(即總分)顯著下降，各處理組總分得分具有顯著差異，但相差較小。

表4 熒光假單胞菌對采后錦橙貯藏品質(zhì)的影響(果肉)Table 4 The effects of P. fluorescens on storage quality of Jincheng orange (flesh)

圖6 熒光假單胞菌對采后錦橙感官品質(zhì)的影響Fig.6 The effects of P. fluorescens on sensory quality of Jincheng orange

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，P.fluorescens在離體條件下可有效抑制P.italicum孢子的萌發(fā)和芽管伸長，說明P.fluorescens可以通過抑制霉菌孢子的萌發(fā)和生長達(dá)到抑制病原霉菌的效果；在混合固體培養(yǎng)基上，P.fluorescens能顯著抑制P.italicum的生長繁殖，中心混合培養(yǎng)時(shí)，原液和菌懸液甚至能完全抑制P.italicum的生長；濾液和熱殺死液也有一定的抑菌作用，但效力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于菌懸液和原液，說明P.fluorescens在生長繁殖過程中可能產(chǎn)生少量的抑菌物質(zhì)，但不是其主要的抑菌方式。魏海雷等[29]報(bào)道P.fluorescens2P24菌株能產(chǎn)生酚類抗生素2,4-二乙酰間苯三酚；李晶等[30]發(fā)現(xiàn)P.fluorescensAbⅢ745-6能產(chǎn)生小分子抑菌物質(zhì)苯胺基甲基乙酸。供試菌株P(guān).fluorescens是否能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，以及產(chǎn)生什么抑菌物質(zhì)，還需進(jìn)一步探討。

P.fluorescens菌懸液處理顯著降低了采后錦橙青霉病的發(fā)病率和病斑直徑，而缺乏活細(xì)胞的濾液與熱殺死液卻對采后錦橙青霉病的抑制作用有限，這些結(jié)果進(jìn)一步說明了P.fluorescens可能具有分泌抗菌性次生代謝產(chǎn)物的能力，但不是其主要的抑菌機(jī)制。P.fluorescens原液處理顯著降低了果實(shí)的發(fā)病率，但其拮抗效果卻明顯弱于同濃度的菌懸液。和原液相比，菌懸液經(jīng)過無菌水反復(fù)洗滌，去除了培養(yǎng)基中殘余的營養(yǎng)成分，P.fluorescens菌懸液的作用效果強(qiáng)于培養(yǎng)液，說明P.fluorescens可能是通過營養(yǎng)和空間的竟?fàn)巵戆l(fā)揮抑制致病菌作用。P.fluorescens菌懸液對采后錦橙青霉病具有明顯的抑制作用，而且菌體濃度與果實(shí)青霉病發(fā)病率呈顯著負(fù)相關(guān)，這些結(jié)果同樣說明營養(yǎng)與空間的競爭在P.fluorescens抑制致病菌過程中起著重要的作用。目前普遍認(rèn)為，拮抗菌能否在果實(shí)傷口處快速繁殖形成優(yōu)勢數(shù)量是決定其能否發(fā)揮其營養(yǎng)競爭和拮抗效力的重要因素[4-5]。本試驗(yàn)中，不論是低溫還是室溫環(huán)境下，P.fluorescens都能在果實(shí)傷口處快速生長繁殖，P.fluorescens在錦橙果實(shí)傷口經(jīng)4 ℃下培養(yǎng)16 d或經(jīng)20 ℃下培養(yǎng)8 d后，其活細(xì)胞數(shù)量分別增長了28倍和34倍，這說明P.fluorescens能快速適應(yīng)果實(shí)傷口處的環(huán)境和營養(yǎng)條件，迅速擴(kuò)大種群數(shù)量，消耗傷口處有限的營養(yǎng)物質(zhì)，占據(jù)生態(tài)位點(diǎn)，從而阻止病原菌侵入；同時(shí)進(jìn)一步反映了P.fluorescens抑制錦橙病害主要是通過營養(yǎng)與空間的競爭。這也與WALLACE等[12]和MIKANI等[13]的研究結(jié)果一致。

CHI和GLU是兩類重要的病程相關(guān)蛋白(pathogensis-related proteins, PR)，能夠單獨(dú)或協(xié)同分解果蔬病原菌的細(xì)胞壁，破壞其結(jié)構(gòu)，從而抑制病原菌的生長，一般認(rèn)為，CHI和GIU可作為誘導(dǎo)處理后植物系統(tǒng)獲得抗病性建立的標(biāo)志[5, 31]。由圖4可知，前期P.fluorescens處理顯著提高了錦橙果皮CHI和GLU的活性，并能誘導(dǎo)提前GLU活性高峰的到來，有效提高果實(shí)的抗性。

和對照相比，P.fluorescens能顯著降低采后錦橙的病情指數(shù)，說明P.fluorescens能在果實(shí)果皮處占據(jù)生態(tài)位點(diǎn)，有效阻礙病原微生物的侵入，延緩錦橙病害進(jìn)程。一般來說，隨著果實(shí)的成熟，果膠物質(zhì)逐漸與纖維素分離，形成易溶于水的可溶性果膠，果實(shí)組織也變得松弛、軟化，果實(shí)硬度下降[24]。然而采后錦橙在貯藏期間，含水量下降，果皮變得干枯、褶皺，韌性增強(qiáng)，因而用質(zhì)構(gòu)儀測得的硬度反而較貯藏前明顯增大；同樣，由于果皮的保護(hù)作用和整個(gè)果實(shí)的失重，貯藏后果肉的含水率反而略微上升。錦橙是可溶性糖分積累型果實(shí)，汁胞中的可溶性糖絕大部分是蔗糖、果糖和葡萄糖，其中，果糖甜度最高，是蔗糖的1.73倍，是葡萄糖的2.7倍[32]。各處理對果糖含量沒有顯著影響，但會(huì)顯著影響葡萄糖和蔗糖的含量，P.fluorescens菌懸液處理導(dǎo)致果肉葡萄糖含量顯著下降、蔗糖含量顯著上升，抑霉唑也會(huì)導(dǎo)致葡萄糖含量下降、蔗糖含量上升，但和對照相比，差異不顯著。由于果實(shí)特有的甜度和風(fēng)味主要取決于糖分的種類和比例[32]，因而各處理會(huì)對果實(shí)的口感和滋味有所影響，這也由后續(xù)的感官評價(jià)結(jié)果所體現(xiàn)。貯藏后，可溶性糖含量顯著升高，TA含量明顯下降，因而滋味得分顯著上升；除此之外，其余各項(xiàng)指標(biāo)的得分均較貯藏前顯著下降；貯藏后，感官指標(biāo)的總分顯著下降，各處理組總分得分具有顯著差異，但相差較小。此外，感官評價(jià)時(shí)，一些指標(biāo)如硬度的評價(jià)得分和儀器測定的數(shù)值剛好呈現(xiàn)相反的變化趨勢，這是由于食品的感官性狀變化很難具體衡量，也由于感官評價(jià)員的主觀態(tài)度各不相同[33]?？偟膩碚f，P.fluorescens處理能顯著抑制P.italicum，并能有效減緩采后錦橙的病害進(jìn)程，延長貯藏時(shí)間。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：(1)P.fluorescens能顯著抑制P.italicum的孢子萌發(fā)和芽管伸長，有效降低采后錦橙青霉病的發(fā)病率和病斑直徑，且P.fluorescens能在錦橙傷口處迅速定殖，生長繁殖，搶占空間位點(diǎn)；(2)P.fluorescens能顯著提高果實(shí)幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性，顯著增強(qiáng)果實(shí)的抗病性；(3)P.fluorescens菌懸液保鮮處理能有效阻礙病原微生物的侵入，延緩采后錦橙病害進(jìn)程，顯著延長貯藏時(shí)間，且對錦橙的貯藏品質(zhì)和感官品質(zhì)影響較小。由此可見，該熒光假單胞菌供試菌株在錦橙采后病害上具有極高的生物防治潛力。