電刺激對牦牛肉成熟過程中肌原纖維蛋白氧化特性的影響

崔文斌,王妍,張麗,馬紀兵,余群力,劉小波,王惠惠

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)

牦牛是高寒地區(qū)特有的牛種，主要分布在高海拔、無污染的高山草原環(huán)境中[1]。牦牛肉具有高蛋白、低脂肪的特性，深受廣大消費者喜愛[2]。蛋白質(zhì)作為肉及肉制品中的主要成分，其對肉品的營養(yǎng)和感官品質(zhì)具有重要作用[3]。蛋白質(zhì)氧化已經(jīng)成為食品化學(xué)領(lǐng)域中最新的研究問題之一[4]。肉與肉制品在成熟及貯藏過程中的氧化現(xiàn)象普遍存在，造成蛋白質(zhì)氧化損傷主要是由脂肪氧化、金屬離子及內(nèi)源氧化劑等引起的氧化反應(yīng)導(dǎo)致的[5]。氧化會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生顯著的變化[6]，氧化還會使肉品色澤變暗，持水性和嫩度下降，食用品質(zhì)劣變，營養(yǎng)價值降低，消費者接受程度下降，被認為是影響肉類食用品質(zhì)的重要因素之一[7]。

電刺激是指對屠宰后動物胴體，在一定的電壓、頻率下作用一定的時間的操作[8]。電刺激能夠改善肉質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)[9]，并且加快內(nèi)源酶對肌原纖維蛋白的水解[10]。同時電刺激還可以改善肉的色澤[11]。DRANSFIELD等[12]研究發(fā)現(xiàn)，電刺激處理在一定程度上改變了肉的時間-溫度-pH值之間的關(guān)系，進而對蛋白酶的活性以及蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)生一定影響，同時加快了肌原纖維蛋白的降解速度，影響了肉的成熟速度。HO等[13]研究發(fā)現(xiàn)，低壓電刺激后背最長肌產(chǎn)生了攣縮帶，并加快了肌聯(lián)蛋白、伴肌動蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解速度。張先峰等[14]在研究電刺激對牛肉肌原纖維結(jié)構(gòu)的影響中發(fā)現(xiàn)，電刺激會產(chǎn)生攣縮帶，使肌纖維微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而確證了肉在宰后成熟期間嫩度改善的具體原因；孫清亮等[15]在電刺激對宰后牛肉肌原纖維蛋白降解的影響中指出，電刺激加快了肌鈣蛋白-T的降解，縮短宰后成熟時間。隨著電刺激技術(shù)的日趨成熟，電刺激技術(shù)由于其較普遍的適用性和高效性已經(jīng)被國外很多肉牛屠宰企業(yè)應(yīng)用到實際生產(chǎn)加工中[16]。宰后成熟過程中的電刺激處理，決定了胴體僵直的性質(zhì)、肌纖維收縮的程度以及肉的嫩化程度，對肉的食用品質(zhì)有顯著影響[17]。但目前，對于牦牛肉電刺激后肌原纖維蛋白氧化變化的分析暫未見報道。

因此本研究對甘肅甘南公牦牛宰后采用電刺激和未電刺激2種方式處理后，取其背最長肌，在0～4 ℃條件下成熟0～14 d的過程中，測定肌原纖維蛋白羰基、總巰基、二硫鍵含量、表面疏水性、K-ATPase活性以及蛋白二級結(jié)構(gòu)等指標，旨在探索電刺激對宰后牦牛肉成熟過程中肌原纖維蛋白氧化特性變化的影響，以期為宰后牦牛肉成熟過程中品質(zhì)控制和改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

選擇甘肅甘南州健康無病的(36±6)月齡公牦牛12頭，電刺激組和未電刺激組各6頭，平均體重(300±50) kg。電刺激組牦牛經(jīng)宰殺、放血后進行電刺激處理(輸出電壓21 V，額定功率50 W，時間90 s)，未電刺激組牦牛宰殺、放血后未經(jīng)電刺激處理，每頭牦牛宰后30 min內(nèi)劈半，在其左半胴體現(xiàn)場采集背最長肌，當即采集0天樣品，在0～4 ℃成熟1、2、3、5、7、14 d，在相應(yīng)時間點取樣待測。

三氯乙酸(TCA)、鹽酸胍、乙酸乙酯、乙醇、KH2PO4、KCl、K2HPO4、Na2CO3、HCl、溴酚藍、甘氨酸、KOH、CuSO4.5 H2O、四水合酒石酸鉀鈉、牛血清白蛋白(BSA)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；SDS(十二烷基磺酸鈉)、Tris、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫二硝基苯甲酸(DTNB)，美國Sigma公司。上述試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

XH-B型渦旋混合器,江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；HI 99163 N便攜式pH測定儀,哈納沃德儀器有限公司；TU-1810 紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司；TGL-24 MC高速臺式冷凍離心機,長沙平凡儀器儀表有限公司；FSH-2A型高速分散器,上海啟前電子科技有限公司；DKS 28水浴鍋,上海雙旭電子有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取

參照PARK等[18]的方法進行測定。

1.2.2 羰基含量的測定

參考LEVINE等[19]的方法進行測定。

1.2.3 巰基含量的測定

總巰基參照KORCHAK等[20]的方法進行測定。

1.2.4 二硫鍵含量測定

二硫鍵按照THANNHAUSER等[21]的方法，進行測定。

1.2.5 K-ATPase活性

參照WELLS等[22]的測定方法。

1.2.6 表面疏水性測定

依據(jù)CHELH等[23]的方法進行測定。

1.2.7 圓二色譜法測定蛋白二級結(jié)構(gòu)

參考WHITMORE等[24]的方法進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上每個處理重復(fù)3次，用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件用Duncan法對所有數(shù)據(jù)進行顯著性分析(p<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羰基含量

牦牛肉成熟過程中不同處理組肌原纖維蛋白羰基含量變化如圖1所示。

圖1 牦牛肉成熟過程中羰基含量的變化Fig.1 Changes of carbonyl content during the maturation of yak meat注：大寫字母表示同一處理組內(nèi)不同時間點組內(nèi)含量差異極顯著(p<0.01)；小寫字母表示同一處理組內(nèi)不同時間點組內(nèi)含量差異顯著性(p<0.05)；“*”表示2種處理在同一成熟時間點組間含量差異顯著(p<0.05)，“**”表示2種處理在同一成熟時間點組間差異極顯著(p<0.01)，下同。

羰基的形成是蛋白質(zhì)發(fā)生氧化的一個最顯著變化，羰基的濃度的高低可以評判蛋白質(zhì)氧化的程度[25]。由圖1可知，隨成熟時間的延長，羰基含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，電刺激組的羰基含量顯著低于未電刺激組(p<0.05)。電刺激處理初期，電刺激組羰基含量為1.71 nmol/mg蛋白，未電刺激組羰基含量為2.018 nmol/mg蛋白，這可能是由于電刺激使牦牛肉蛋白中一些不穩(wěn)定的羰基化合物降解引起的。當成熟至第14天時，電刺激組羰基值為4.15 nmol/mg蛋白，未電刺激組為6.35 nmol/mg蛋白(p<0.01)，與未電刺激組相比，電刺激組羰基含量少增加了2.2 nmol/mg蛋白(p<0.01)，蛋白氧化程度低于未電刺激組。

2.2 總巰基和二硫鍵

電刺激和未電刺激對牦牛肉肌原纖維蛋白中總巰基和二硫鍵含量的影響如圖2和圖3所示。

圖2 牦牛肉成熟過程中巰基含量的變化Fig.2 Changes of Sulfhydryl Content during Yak Meat Mature

圖3 牦牛肉成熟過程中二硫鍵含量的變化Fig.3 Changes of disulfide content during maturation of yak meat

蛋白質(zhì)氧化會導(dǎo)致蛋白質(zhì)中巰基交聯(lián)形成二硫鍵，從而造成巰基含量的下降[26]。由圖2、圖3可知，電刺激處理初期，與未電刺激組巰基、二硫鍵含量(88.17、10.24 nmol/mg蛋白)相比，成熟3 d時未電刺激處理組的巰基顯著降低了12.5%，二硫鍵含量分別顯著增加了29.1%、21.9%、27.7%、9.2%、19.1%(p<0.05)。在成熟14 d內(nèi)，各組巰基含量不斷下降，二硫鍵含量不斷生成，這可能是因為氧化導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)伸展，從而使臨近的巰基生成二硫鍵[27]。綜合圖2、圖3顯示電刺激導(dǎo)致蛋白氧化速率減緩，在同一成熟時間，電刺激顯著影響了蛋白質(zhì)中巰基的交聯(lián)程度及形成的二硫鍵數(shù)量。

2.3 K-ATPase活性

電刺激和未電刺激對牦牛肉肌原纖維蛋白中K-ATPase酶活性的影響如圖4所示。

圖4 牦牛肉成熟過程中K-ATPase活性的變化Fig.4 Changes of K-ATPase activity during maturation of yak meat

ATP水解釋放能量能夠驅(qū)動肌肉的收縮，因而ATP酶的活性既可以作為肌球蛋白構(gòu)象變化的一個指標，也是ATP消耗和肌肉收縮標志[28]。由圖4可知，隨著成熟時間的延長，電刺激組和未電刺激組牦牛肉K-ATPase活性均呈下降趨勢，且電刺激組的K-ATPase活性下降程度較未電刺激組低。電刺激組成熟第3天時K-ATPase活性與未電刺激組差異極顯著(p<0.01)。表明電刺激影響了牦牛肉成熟過程中K-ATPase活性的變化，減緩了牦牛肉成熟過程中蛋白氧化的程度。

2.4 表面疏水性

電刺激和未電刺激對牦牛肉肌原纖維蛋白中表面疏水性的影響如圖5所示。

圖5 牦牛肉成熟過程中表面疏水性變化Fig.5 Surface hydrophobicity changes during maturation of yak meat

由圖5可知，隨著成熟時間的延長，電刺激組和未電刺激組牦牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性均呈先上升后下降趨勢，電刺激組的表面疏水性較未電刺激組高。未電刺激組表面疏水性在牦牛肉成熟第7天與成熟第3天、第5天差異顯著(p<0.05)，與成熟第0天、第1天和第14天差異極顯著(p<0.01)。電刺激組表面疏水性在牦牛肉成熟第5天與成熟第1天、第2天、第3天和第7天的表面疏水性呈顯著性差異(p<0.05)，與成熟第1天和第14天呈極顯著差異(p<0.01)。蛋白質(zhì)表面疏水性可用來衡量蛋白質(zhì)的變性程度，表面疏水性的增加則說明它的變性程度增加[23]。該研究中發(fā)現(xiàn)，電刺激和未電刺激組的蛋白其表面疏水性均有顯著的增加，且電刺激組表面疏水性高于未電刺激組。

2.5 蛋白二級結(jié)構(gòu)

電刺激和未電刺激對宰后牦牛肉成熟過程中肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響如表1所示。

氧化會導(dǎo)致肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)展開，使得α-螺旋含量隨著氧化程度的加深而逐漸降低。肌原纖維蛋白氧化程度不同，導(dǎo)致其α-螺旋含量的降低幅度也產(chǎn)生差異。輕度氧化蛋白的降低量顯著高于深度氧化蛋白[29]。對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)通過曲線擬合的方法進行定量分析。表1為不同成熟時間過程中電刺激和未電刺激下牦牛肉肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)相對含量的變化情況。由表1可知，經(jīng)過電刺激作用的影響，牦牛肉肌原纖維蛋白中的α-螺旋、β-折疊程度下降，而無規(guī)則卷曲比例升高；成熟時間越長，α-螺旋比例降低趨勢越緩慢，由表1可以發(fā)現(xiàn)，成熟2 d的牦牛肉中α-螺旋比例顯著低于成熟14 d的牦牛肉，結(jié)果會促進牦牛肉肌原纖維蛋白的復(fù)性[30]。α-螺旋結(jié)構(gòu)在空間位阻上要比β-轉(zhuǎn)角大，因此與α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相比較，其氨基酸殘基更容易受外加因素的影響[31]，在成熟2 d時，牦牛肉β-轉(zhuǎn)角含量下降到最低。以上試驗結(jié)果說明，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變性情況與電刺激作用可能有關(guān)。

表1 牦牛肉成熟過程中蛋白二級結(jié)構(gòu)變化Table 1 Protein secondary structure changes duringmaturation of yak meat

注：小寫字母表示同一處理組內(nèi)不同時間點數(shù)據(jù)間差異顯著性(p<0.05)，大寫字母表示同一處理組內(nèi)不同時間點數(shù)據(jù)間差異極顯著(p<0.01)。

3 討論

低壓電刺激可以改變?nèi)赓|(zhì)微觀結(jié)構(gòu)[32]，使其肌節(jié)收縮、肌原纖維直徑變小、肌原纖維小片化程度增大，同時加快內(nèi)源酶對肌原纖維蛋白的水解[33]，提升品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本。有研究指出，電刺激使內(nèi)源酶對蛋白質(zhì)的降解速度減慢[34]，內(nèi)源酶又會對蛋白氧化產(chǎn)生積極作用，由此，電刺激可能減緩了蛋白氧化的速度。

本研究發(fā)現(xiàn)，在成熟過程中，電刺激組牦牛羰基含量低于未電刺激組，且成熟至14 d時，電刺激組羰基含量4.15 nmol/mg蛋白極顯著低于未電刺激組6.35 nmol/mg蛋白(p<0.01)，較未電刺激組低34.65%，表明電刺激可減少牦牛肉成熟過程中羰基的生成。電刺激組和未電刺激組牦牛肉成熟過程中肌原纖維蛋白巰基含量均呈下降趨勢，且電刺激組巰基含量較未電刺激組下降緩慢，表明在牦牛肉成熟過程中，電刺激會抑制巰基數(shù)量的減少，即對蛋白氧化有抑制作用，這與STADTMAN[35]對肉品蛋白氧化與成熟過程中的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明電刺激作用在短時間內(nèi)顯著改善牦牛肉肌原纖維蛋白的特性，這與李春強[29]研究的豬肉肌原纖維蛋白氧化程度中K-ATPase酶活性的變化結(jié)果一致。電刺激處理組顯著的提高K-ATPase酶活性(p<0.05)，當K-ATPase被激活以后，隨著宰后時間的延長，電刺激處理組的活性顯著降低，但與對照組K-ATPase酶活性降低的速度相比，電刺激組K-ATPase酶活性降低的程度較大；蛋白質(zhì)的表面疏水性是反映蛋白結(jié)構(gòu)展開程度的重要指標，在牦牛肉成熟過程中，電刺激作用抑制了肌原纖維蛋白表面疏水性的增加，這與CHELH等[23]對豬肉肌原纖維疏水性測定中的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

2個處理組牦牛肉羰基含量和二硫鍵含量隨成熟時間的延長均逐漸增加。電刺激組羰基增加量和二硫鍵增加量均低于未電刺激組，且成熟至第14天，電刺激組羰基含量極顯著低于未電刺激組。蛋白氧化程度低于未電刺激組。

2個處理組牦牛肉巰基含量和K-ATPase酶活性隨著成熟時間的延長均逐漸降低。電刺激組巰基含量和K-ATPase酶活性下降程度均低于未電刺激組，且成熟至3天時，兩處理組巰基含量達到顯著差異，K-ATPase酶活性變化達到極顯著差異。