酸肉發(fā)酵過程中蛋白質的變化及對消化特性的影響

韋誠，段珍珍，常榮，周才瓊*

1(西南大學 食品科學學院，暨重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715) 2(習水縣市場監(jiān)督管理局，貴州 遵義，56400)

酸肉是流行于貴州、重慶、湖南、廣西及江西等一帶少數(shù)民族地區(qū)的一種特色發(fā)酵肉制品，具有酸香濃郁、易于消化等特點[1]。其多為家庭手工作坊生產，以持續(xù)發(fā)酵作為保藏方式，食用周期多達半年以上。由于長時間處于一定微生物和酸的條件下，使酸肉成為一個動態(tài)體系，酸肉的風味、營養(yǎng)及安全都會發(fā)生相關變化。

近年來，對肉制品品質的研究不再局限于通過物理品質、感官品質或微生物安全的評價，許多研究者開始從蛋白質和脂肪的理化性質和結構特性的變化角度出發(fā)，更深層次地研究原料肉在加工過程中品質的形成和劣變相關機理。蛋白質作為肉類的重要組成成分，其在加工貯藏過程中發(fā)生的氧化、降解及結構改變等理化變化對肉制品品質起著關鍵性作用。其中，蛋白質的降解最重要且對最終產品感官特性影響顯著[2]。一方面，蛋白質在組織蛋白酶和微生物胞外蛋白酶作用下發(fā)生降解，生成小肽、游離氨基酸，甚至酮酸、胺和醛等風味物質或風味前體物[3-4]，在一定程度上有利于風味的發(fā)展和促進產品的消化吸收[5]。另一方面，蛋白質的持續(xù)降解可能會導致產品產生金屬味、苦澀味、酸澀味，加速產品腐敗。此外，加工過程中蛋白質也容易發(fā)生氧化修飾，適當?shù)难趸欣陲L味的形成和蛋白消化率的提高，而嚴重的蛋白氧化引起的疏水性變化、羰基化及交聯(lián)聚集則可能會導致消化率下降[6]。對發(fā)酵食品而言，發(fā)酵既是一種加工方法也是一種食物保藏方法，不但延長了產品的貨架期，還促進風味和營養(yǎng)價值的提升[7]。而肉類在發(fā)酵過程中牽涉了許多復雜的物理、生物化學和微生物的變化，主要包括：pH值降低、微生物區(qū)系的改變、亞硝酸鹽還原及亞硝基血紅蛋白生成、肌漿蛋白和肌原纖維蛋白溶解度的改變、蛋白組成的變化、酸化及蛋白凝膠化等[7-8]。這些變化與發(fā)酵時間、發(fā)酵劑、溫度及輔料(如鹽)添加量等密切相關。然而，目前關于酸肉發(fā)酵過程中蛋白質的變化這方面的報道相對較少且不夠深入[9]。

該文從蛋白質降解和聚集角度考察酸肉在長時間發(fā)酵過程中蛋白質的基本變化規(guī)律，旨在為酸肉在長時間發(fā)酵過程中有關蛋白質的變化及對酸肉蛋白質營養(yǎng)價值的影響提供依據(jù)，為合理控制發(fā)酵時間，以及何時食用提供有關蛋白質變化的支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮豬里脊(背最長肌)、湖北大米及加碘食用鹽，重慶北碚天生路永輝超市。大米炒至微黃后，粉碎機粉碎后過20目篩，備用。

1.2 主要試劑

尿素、NaOH、十二烷基硫酸鈉(SDS)、NaCl、三氯乙酸、KCl、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、NaH2PO4、KH2PO4、β-巰基乙醇、茚三酮、考馬斯亮藍R-250等化學試劑，均為分析純；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，碧云天生物技術有限公司。

1.3 主要儀器與設備

UV-2450紫外分光光度計,日本島津公司；ZEN3690馬爾文激光粒度儀,英國馬爾文儀器公司；Bio-Rad電泳儀,伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司；JSM-6510LV鎢燈絲掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社(JEOL)。

1.4 實驗方法

1.4.1 酸肉制備及處理

新鮮豬肉，洗凈瀝干，切成約3 cm×5 cm×0.5 cm薄片，按m(原料肉)∶m(米粉)∶m(食鹽)=85∶10∶5加入配料，揉制數(shù)分鐘裝壇，并用新鮮粽葉壓緊塞住發(fā)酵壇口，倒置，水密封，后于20～25 ℃發(fā)酵。分別于發(fā)酵第0，20，50，80，110，140，180天取樣分析。

1.4.2 非蛋白氮的測定

參照廖定容[10]的方法，刷掉附在酸肉表面的米粉并剔除可見脂肪和筋膜，稱取絞碎的肉樣10 g于錐形瓶中，加入90 mL蒸餾水，室溫振搖40 min，過濾后取25 mL濾液，加入25 mL質量分數(shù)為10%的TCA溶液。再次過濾后取10 mL濾液消化，采用凱氏定氮法測定非蛋白氮含量。

1.4.3 蛋白質組成分析

(1)蛋白質組成：參照SUN等[11]的方法。稱取絞碎肉樣4 g，加入10倍提取液A(15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L KH2PO4)，冰浴中以10 000 r/min高速勻漿1 min，接著將勻漿液冷凍離心(7 500×g，15 min)，該步驟重復2次，收集上清液和沉淀。①上清液部分：加入50%TCA使上清液TCA終濃度為10%，以7 500×g冷凍離心15 min，所得沉淀為肌漿蛋白。②沉淀部分：加入10倍提取液B(0.45 mmol/L KCl，15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L KH2PO4)，以10 000 r/min勻漿1 min，將勻漿液離心(7 500×g，15 min)，此提取步驟重復1次，合并上清液，即得肌原纖維蛋白。此次得到的沉淀作如下處理：用10倍體積的0.1 mol/L NaOH振蕩提取4 h，離心，上清液為堿溶蛋白，沉淀為肌基質蛋白。堿溶蛋白和肌原纖維蛋白含量采用雙縮脲法測定，肌漿蛋白和肌基質蛋白經凍干后采用凱氏定氮法測定。

(2)蛋白質SDS-PAGE：按SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明配制10%的分離膠，5%的濃縮膠。電泳測試條件：剛開始采用15 mA恒流，至分離膠時換成25 mA恒流，當溴酚藍指示條帶靠近分離膠底部時立刻終止操作。取下電泳膠塊，放入染色液[0.25%考馬斯亮藍，V(甲醇)∶V(冰醋酸)∶V(蒸餾水)=45∶10∶45]中染色1 h，隨后轉入脫色液[V(甲醇)∶V(冰醋酸)∶V(蒸餾水)=25∶10∶65]中搖床脫色至凝膠底色脫盡。

1.4.4 蛋白質聚集分析

(1)蛋白質濁度：肌漿蛋白濁度測定參照吳滿剛[12]的方法，肌原纖維蛋白質濁度參照許艷順[13]的方法。先將蛋白用1.4.2對應的提取液稀釋至1 mg/mL，肌漿蛋白做如下處理：在25 ℃放置20 min后，340 nm處測定吸光度。肌原纖維蛋白處理如下：取1 mL肌原纖維蛋白溶液(1 mg/mL)加入4 mL內含不同濃度尿素(0、1.875、10 mol/L) 的0.6 mol/L NaCl溶液，調整其最終濃度為0.2 mg/mL，尿素濃度分別為0、1.5、8 mol/L。渦旋混合均勻后，室溫靜置15 min，分別于350 nm處測定吸光值(OD350)。

(2)蛋白質粒徑：參考李學鵬等[14]的方法。采用馬爾文激光粒度儀測定肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和堿溶蛋白的粒徑。提取的各種蛋白溶液磁力攪拌30 min后用4層紗布過濾除去不溶性物質，將蛋白質濃度調整至5 mg/L。參數(shù)設定：掃描角度90 ℃，溫度25 ℃。

1.4.5 肌肉微觀結構觀察

參考WATTANACHANT等[15]的方法制樣并略作修改。將肉樣切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的規(guī)格，在含有質量分數(shù)為2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.2)中4 ℃固定24 h，再將樣品切成2 mm×2 mm×2 mm的規(guī)格，接著用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.2)清洗，再接著用30%，50%，70%，80%，95%，100%乙醇逐級脫水(每級1 h)。經液氮冷凍后放入冷凍干燥機中干燥，將干燥樣品噴金，掃描電鏡下觀察結果。

1.4.6 蛋白質體外消化率

參照LI等[16]的方法并略微修改，用消化后的蛋白質含量占消化前蛋白質含量的百分比表示。胃蛋白酶消化率處理如下：準確稱取肉樣(2.0 g)，加入8 mL PBS(10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.0)并在4 ℃下均質(2×30 s，9 500×g；2×30 s，13 500×g)，用1 mol/L HCl將勻漿液pH值調至2.0，并以1∶31.25的質量比(以肉樣為質量基位)添加胃蛋白酶，混合反應液于37 ℃恒溫水浴2 h(每隔10 min搖勻1次)，然后用1 mol/L NaOH將pH值調至7.5以滅酶結束反應。胃蛋白酶+胰蛋白酶體外消化率處理如下：在前述胃蛋白酶消化基礎上，接著再以1∶50的質量比(以肉樣為質量基位)添加胰蛋白酶，繼續(xù)將混合物于37 ℃水浴反應2 h，接著用95 ℃水浴加熱5 min滅酶終止反應。加入3倍體積的乙醇以沉淀反應體系中未被消化的蛋白質，4 ℃放置12 h后于4 ℃條件下以10 000×g離心20 min，棄上清，將沉淀中的乙醇揮發(fā)完全，采用凱氏定氮法測定沉淀的蛋白含量。按下列公式計算蛋白消化率：

式中：W0為未消化的蛋白質含量；W1為經酶消化后的蛋白質含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

結果以平均值±標準差表示，采用Origin 8.6作圖，SPSS 22.0進行單因素方差分析和相關性分析。p<0.01表示極顯著，p<0.05表示顯著。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中非蛋白氮(NPN)含量的變化

如圖1所示，發(fā)酵0～80 d期間NPN含量不斷增長(p<0.05)，由13.96 mg/g上升至23.25 mg/g，隨著發(fā)酵的繼續(xù)NPN含量則繼續(xù)緩慢增加，說明發(fā)酵過程中蛋白質一直處于被水解狀態(tài)。該變化趨勢與馬艷梅等[17]對火腿的研究、HU等[18]對魚糜、香腸的研究結果相似。有研究報道，NPN的含量發(fā)生變化可能是由一些微生物或內源性蛋白酶將蛋白氮轉變?yōu)镹PN造成的，也可能是環(huán)境中較低的pH值誘導蛋白結構改變，進而促進NPN含量升高[19]。

圖1 發(fā)酵過程中非蛋白氮含量的變化Fig.1 Changes in non-protein nitrogen content during fermentation

2.2 酸肉發(fā)酵過程中蛋白質的變化

2.2.1 酸肉發(fā)酵過程中蛋白質組成變化

不同發(fā)酵時段酸肉的蛋白組成變化如圖2，發(fā)酵0 d時肌原纖維蛋白含量最高，約占總蛋白的60.45%，其次是肌漿蛋白約占35.68%，而堿溶蛋白和肌基質蛋白含量相對較少，分別約占總蛋白的4.8%和2.3%。隨著發(fā)酵時間的延長，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量顯著降低，而堿溶蛋白顯著增加(p<0.05)，特別是發(fā)酵前期20 d的含量變化最為明顯，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白分別降至發(fā)酵0 d時的59.28%和58.20%，堿溶蛋白增至發(fā)酵0 d的6.92倍；發(fā)酵180 d時，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白分別為發(fā)酵0 d時的27.21%和21.19%，堿溶蛋白為發(fā)酵0 d時的8.76倍，而肌基質蛋白含量在整個發(fā)酵過程中變化不大。肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量的減少可能與發(fā)酵過程中pH值降低(產酸)導致其發(fā)生變性聚集[20-21]，使其鹽溶性下降而變成了可溶于堿性溶液的蛋白有關。其次，在肌肉內源酶和微生物胞外酶共同作用下發(fā)生降解，生成了肽和游離氨基酸等物質。該變化趨勢與孫為正[22]、VISESSANGUAN等[23]、許艷順等[13]對相關發(fā)酵肉制品的研究報道相似。

圖2 酸肉蛋白質組成在發(fā)酵中的變化Fig.2 Changes in protein composition of sour meat during fermentation

2.2.2 不同發(fā)酵時段酸肉蛋白SDS-PAGE電泳分析

SDS-PAGE結果如圖3。從肌漿蛋白電泳圖譜(A)可知，發(fā)酵0 d肌漿蛋白分子量主要分布在14～180 kDa之間。具體來說，20 d時約100、63 kDa蛋白條帶消失；發(fā)酵20、50和80 d時，48、45和30 kDa的蛋白條帶無明顯變化，但相對0 d均變得很淺，而在110 d后，這些蛋白條帶幾乎完全消失；14.4～25 kDa蛋白條帶均在發(fā)酵80 d后消失；約66.2 kDa和60 kDa附近的蛋白條帶無明顯變化。值得注意的是，在發(fā)酵0 d時約30～35 kDa有4條蛋白條細帶，發(fā)酵20 d變?yōu)?條寬帶，110 d后只剩下一條顏色較深的寬帶，推測可能由于發(fā)酵產酸導致該區(qū)間的蛋白質變性聚集或是發(fā)生持續(xù)降解所致?？傊?，隨著發(fā)酵時間的延長，肌漿蛋白電泳圖出現(xiàn)蛋白條帶逐漸變淺或消失，說明了肌漿蛋白發(fā)生了降解或變性聚集，也說明了其含量不斷降低。

圖3 酸肉各蛋白組分電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoretograms of sarcoplacmicproteins(A), myofibrillar proteins(B), alkali-soluble proteins(C)

肌原纖維蛋白的特征條帶可歸屬為肌球蛋白重鏈(MHC，200 kDa)、α-輔助激動蛋白(94 kDa)，原肌球蛋白(80 kDa)、肌鈣蛋白(75 kDa)，肌動蛋白(45 kDa)、肌球輕鏈(20 kDa)。由肌原纖維蛋白電泳圖(圖3-B)看出，與0 d相比，發(fā)酵20 d時MHC和肌動蛋白條帶明顯變細且顏色變淺，50 d時基本消失，說明MHC和肌動蛋白在發(fā)酵過程中其含量在不斷減少；約66.2～180 kDa區(qū)域的蛋白條帶在20～80 d時有的顏色變淺，有的發(fā)生消失并在附近生成了新的條帶，而在110 d后則變成色深、帶寬而清晰的3條蛋白條帶(116、75和66.2 kDa)。63 kDa處的條帶顏色先加深，110 d時再次加深，說明其是肌原纖維蛋白中大分子蛋白的主要降解產物之一。約35 kDa處蛋白條帶在發(fā)酵20 d后顏色加深，50 d后變成了帶寬而色深的蛋白條帶，并發(fā)現(xiàn)其在整個發(fā)酵階段的變化趨勢與肌動蛋白相反，因此推斷肌動蛋白可能降解成了約35 kDa的蛋白質分子。其他一些發(fā)酵肉制品的肌原纖維電泳圖譜均顯示MHC和肌動蛋白條帶逐漸變淺至消失的現(xiàn)象[22]。對酸肉而言，最有可能是乳酸菌產酸和添加的質量分數(shù)為5%食鹽的滲透直接或間接影響蛋白質降解或變性所致，如張平等[24]研究發(fā)現(xiàn)，食鹽能促進大分子蛋白(>180kDa)降解，且在貯藏后期也發(fā)現(xiàn)許多蛋白條帶的消失現(xiàn)象。此外，從整體看，各發(fā)酵時段蛋白條帶變化明顯，其中50、80 d的條帶較相似，110、140、180 d圖譜基本一致，尤其發(fā)酵110 d后出現(xiàn)許多蛋白條帶的消失并生成寬而深的條帶，可能由于肌原纖維蛋白進一步降解，同時部分小分子蛋白重新聚合而成大分子蛋白引起的。此外，也可能由于此時蛋白嚴重變性引起溶解度改變，導致某些分子量蛋白不易被提取出來。

堿溶性蛋白電泳圖(圖3-C)顯示其最初主要是由200 kDa和45 kDa構成。發(fā)酵20 d后，這2種蛋白條帶顏色明顯減弱直至消失，說明此時堿溶性蛋白發(fā)生了一定程度的降解。與此同時，約135、35、30 kDa有新條帶產生。同樣，14.4 kDa處有新條帶生成，說明堿溶性蛋白中的大分子降解產生了一些小分子蛋白片段。此外，高于245 kDa區(qū)域內的蛋白片段在發(fā)酵80 d時明顯增多，可能由于部分蛋白通過自由基鍵合作用，相互連接生成了大分子蛋白聚集體而堆積在分離膠頂部[25]。此外，堿溶性蛋白的部分條帶如200、45kDa處的條帶與肌原纖維蛋白的變化有一定相似性，說明肌原纖維蛋白變性是引起堿溶性蛋白含量上升的原因之一。

2.3 酸肉發(fā)酵過程中的蛋白質聚集情況分析

2.3.1 蛋白質濁度的變化

蛋白質濁度在一定程度上可以反映蛋白質的聚集情況，其值越大，說明聚集程度越大。由圖4可知，肌漿蛋白吸光值在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)波動上升的趨勢，可能的原因是肌漿蛋白在發(fā)酵過程中存在不斷聚合以及聚合蛋白體又被解離降解有關。而其他發(fā)酵階段的肌漿蛋白的濁度值均高于0 d時，說明其結構發(fā)生了改變，這可能與疏水基團過度暴露，蛋白發(fā)生疏水聚集有關[12]。

圖4 發(fā)酵過程中肌漿蛋白濁度的變化Fig.4 Changes in turbidity of sarcoplasmic protein during fermentation

1.5 mol/L的尿素(urea)能夠打破分子間或分子內的氫鍵，8 mol/L的尿素則能夠打破氫鍵及破壞疏水作用。肌原纖維蛋白在含有不同濃度尿素的0.6 mol/L NaCl溶液中的濁度變化如圖5。在不含尿素的0.6 mol/L NaCl溶液中，肌原纖維蛋白濁度呈快速上升后保持穩(wěn)定略升的趨勢，在發(fā)酵110 d達峰值；在1.5 mol/L尿素溶液中呈逐漸增加后保持穩(wěn)定略降的趨勢，在發(fā)酵80 d時達峰值，但是其濁度值均低于在0.6 mol/L NaCl的濁度值；在濃度為8 mol/L尿素溶液中時，濁度值呈略降后緩慢上升趨勢，且各發(fā)酵階段的濁度值均低于低濃度尿素處理時的濁度，說明肌原纖維蛋白在NaCl溶液中濁度的增加與氫鍵和疏水作用有關，也說明發(fā)酵可使酸肉蛋白之間的疏水相互作用增強從而引起蛋白發(fā)生疏水聚集。該結果與許艷順[13]報道類似。

圖5 發(fā)酵過程中肌原纖維蛋白濁度的變化Fig.5 Changes in turbidity of myofibrillar proteins during fermentation

2.3.2 蛋白質粒徑的變化

各發(fā)酵時段蛋白組分平均粒徑變化如表1。與發(fā)酵0 d相比，肌漿蛋白平均粒徑顯著增加(p<0.05)，發(fā)酵180 d時粒徑為發(fā)酵0 d的2.99倍，峰值粒徑出現(xiàn)在發(fā)酵110 d。肌原纖維蛋白在發(fā)酵中粒徑呈波動變化，峰值粒徑出現(xiàn)在發(fā)酵180 d，為發(fā)酵0 d的1.24倍。堿溶性蛋白平均粒徑呈先快速增加后波動變化。這說明發(fā)酵后酸肉蛋白發(fā)生變性導致蛋白聚集體形成，也印證了濁度增加的原因。而各種波動性的變化主要與蛋白質降解、蛋白聚集體的不斷形成和解離有關。這些變化最終都會導致酸肉微觀結構和蛋白質營養(yǎng)特性發(fā)生改變。

表1 發(fā)酵過程中酸肉蛋白平均粒徑的變化單位：nm

注：結果以均值±標準差表示，n=3，同一行數(shù)據(jù)不同字母表示顯著性差異(p<0.05)；ND表示未檢出。

2.4 發(fā)酵酸肉微觀結構變化

觀察酸肉SEM結果可知(圖6)，發(fā)酵0 d時肌纖維束結構完整、排列緊密、肌束間界限分明且空隙較小、紋理清晰。

A-G依次代表發(fā)酵0，20，50，80,110,140,180 d樣品圖；箭頭a-肌纖維束；箭頭b-肌束間隙圖6 不同發(fā)酵時段酸肉的橫截面微觀結構圖(×250倍)Fig.6 SEM of sour meat during different fermentation time

發(fā)酵20 d時，酸肉組織結構完整性遭到輕度破壞、肌纖維明顯收縮、結構開始變得疏松、肌內膜開始破裂、肌束間隙略微增大。發(fā)酵20～80 d,肌纖維排列更加混亂、肌束間隙更加明顯、肌纖維邊界更加模糊并伴有明顯的斷裂等。發(fā)酵80 d之后，可能由于蛋白的進一步降解及凝膠化加劇，導致肌束膜被嚴重破壞，進而導致部分肌纖維束發(fā)生崩塌使它們相互黏成一塊，肌肉橫截面紋理也變得很不規(guī)則。其中，肌內膜有保持肌肉的完整性、阻止肌纖維遭到損傷的作用，其破裂可導致致密的結構破損和營養(yǎng)成分的流失。樊明明[26]報道發(fā)酵后的肉脯肌原纖維結構遭到嚴重破壞，認為是發(fā)酵劑分泌的蛋白酶促進了肌纖維間連接蛋白和小蛋白水解所致，并推測如果發(fā)酵繼續(xù)，肉脯蛋白會進一步水解，纖維間的間隙和空洞會變得更大。

2.5 發(fā)酵時長對酸肉蛋白質體外消化率的影響

不同發(fā)酵時段酸肉蛋白質的體外消化率如圖7。無論是單獨使用胃蛋白酶還是胃蛋白結合胰蛋白酶處理，消化率均高于發(fā)酵0 d，說明發(fā)酵能夠在一定程度上促進蛋白質消化性提高。單獨使用胃蛋白酶時，發(fā)酵前50 d蛋白消化率顯著升高(p<0.05)并于50 d達到峰值，但隨著發(fā)酵時間延長，消化率逐漸下降，其中發(fā)酵50～110 d消化率無顯著性差異(p>0.05)。采用胃蛋白酶+胰蛋白酶消化時，各階段消化率差異顯著(p<0.05)，在發(fā)酵前80 d蛋白質消化率顯著升高，隨著發(fā)酵的繼續(xù)，消化率略微下降。這些結果表明，發(fā)酵明顯影響了肌肉蛋白對消化酶的水解敏感性，發(fā)酵過程中蛋白質適度變性使其暴露出更多消化酶作用位點，從而促進消化率提高。長時間發(fā)酵可能由于蛋白質較高水平的氧化和聚集，消化酶作用位點被掩埋導致消化率降低[27]。此外，胃蛋白酶和胰蛋白酶都有固定的作用位點，當作用位點的氨基酸被氧化后，消化率下降[6]。

圖7 不同發(fā)酵保藏時段酸肉蛋白質的消化率變化Fig.7 Changes in vitro digestibility of sour meat protein during fermentation注：不同小寫字母表示胃蛋白酶體外消化率差異顯著；不同大寫字母表示胃蛋白酶+胰蛋白酶體外消化率差異顯著(p<0.05)。

2.6 蛋白質變化及與體外消化率的相關性分析

由表2可知，蛋白組分間均呈較好的相關性(p<0.01)。其中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白與堿溶性蛋白呈極顯著負相關(p<0.01)，表明發(fā)酵后酸肉中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白部分發(fā)生變性，進而生成堿溶性蛋白。由體外消化率與蛋白組分相關性分析可知，胃蛋白酶體外消化率與堿溶性蛋白存在極顯著正相關(p<0.01)，而胃蛋白酶+胰蛋白酶體外消化率與肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、堿溶性蛋白極顯著相關(p<0.01)。通常認為蛋白質適度變性和降解可在一定程度上促進產品消化率和較好滋味的形成，但過度氧化聚集或降解則會對消化率或滋味等品質產生消極影響，如大量小肽的累積反而會導致產品滋味變差[28]。

表2 發(fā)酵過程中蛋白質的變化及與消化性的相關性分析Table 2 Correlation analysis between changes of proteinand digestion during fermentation

注：*表示相關性在 0.05 水平上顯著(雙側)；**表示相關性在 0.01 水平上顯著(雙側)。SP：肌漿蛋白；MP：肌原纖維蛋白；JR：堿溶蛋白；JZ：肌基質蛋白；PD1：胃蛋白酶消化率；PD2：胃蛋白酶+胰蛋白酶消化率。

3 結論

本文研究了酸豬肉在長時間發(fā)酵中蛋白質降解及聚集變化，以及肌肉微觀結構和蛋白質體外消化情況，發(fā)現(xiàn)長時間發(fā)酵使蛋白組分顯著變化，其中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量均隨發(fā)酵時間延長不斷減少，堿溶性蛋白則不斷增加并在發(fā)酵20 d時成為酸肉中主要的蛋白組成分，同時非蛋白氮含量呈不斷增長趨勢。SDS-PAGE圖譜顯示，隨著發(fā)酵進行，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的蛋白條帶數(shù)不斷減少或直至消失，尤其發(fā)酵110 d后條帶數(shù)最少，但有寬而深的條帶產生，說明發(fā)酵過程中蛋白不斷發(fā)生降解并可能有蛋白聚集體形成。堿溶蛋白某些蛋白條帶變化趨勢與肌原纖維蛋白相似，說明肌原纖維蛋白變性是導致堿溶性蛋白含量增加的主要原因。發(fā)酵20 d后肌漿蛋白和肌原纖維蛋白濁度增加，兩者及堿溶蛋白平均粒徑也有所增加并在發(fā)酵過程中呈波動變化，說明蛋白在發(fā)酵過程中發(fā)生了聚集，但聚集體又不斷被分解。這些結果表明，發(fā)酵過程中蛋白的變性聚集并未阻止蛋白的持續(xù)降解。肌肉微觀結構顯示，肌原纖維結構完整性明顯受到破壞，尤其到中期后可能由于蛋白的進一步降解及凝膠化加劇，導致肌束膜被嚴重破壞。此外，體外消化實驗顯示發(fā)酵在一定程度上促進蛋白質消化率，但在發(fā)酵后期，可能由于大量蛋白聚集體的形成淹沒了蛋白酶作用位點，導致體外消化率降低，表明長時間發(fā)酵保藏酸肉可影響蛋白質消化率。從本研究結果觀察酸肉以發(fā)酵50～80 d為宜。