肌內(nèi)脂肪對(duì)牛背最長(zhǎng)肌品質(zhì)的影響及肌內(nèi)脂肪沉積機(jī)制的研究

毛衍偉，張一敏，朱立賢，董鵬程，梁榮蓉，戴瑨，羅欣

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271018)

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)的發(fā)展，肌內(nèi)脂肪沉積豐富的高檔育肥牛肉受到越來(lái)越多消費(fèi)者的喜愛(ài)。肌內(nèi)脂肪俗稱大理石花紋，影響牛肉的嫩度、風(fēng)味、多汁性等食用品質(zhì)，受遺傳因素、動(dòng)物年齡和營(yíng)養(yǎng)水平等影響[1]。然而，高檔育肥牛肉高投入低產(chǎn)出的現(xiàn)狀困擾著牛肉產(chǎn)業(yè)，削弱了企業(yè)的盈利能力。

目前，對(duì)遺傳因子與牛生產(chǎn)性能、牛肉品質(zhì)關(guān)系的研究成為熱點(diǎn)，主要包括影響牛肉食用品質(zhì)基因的鑒定、飼養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)與成脂基因表達(dá)模式的關(guān)系等。使用基因芯片技術(shù)掃描安格斯×西門塔爾牛的基因，通過(guò)探討相關(guān)基因與脂肪沉積能力的關(guān)系，確定了MYH3、HOXD10、MXRA8、CASQ2、NPNT、MRC1、DNER和CYPB4的表達(dá)量與大理石花紋沉積能力相關(guān)[2]；對(duì)瘦肉型品種利木贊與肥牛型品種荷斯坦×霍斯坦雜交牛、海福特公牛的基因表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比分析表明，肥瘦兩個(gè)類型的品種間有144個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因涉及前脂肪細(xì)胞的分化與增殖、脂肪細(xì)胞成熟、脂肪形成和新陳代謝[3]。還有研究指出肉?；駾GAT1、 FABP4、FASN、PPARGC1A[4]、FADS2[5]、Fas (APO-1, TNFRSF6)基因[6]的多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量、脂肪酸組成相關(guān)。然而，上述對(duì)肉牛肌內(nèi)脂肪沉積基因的研究，都是根據(jù)基因的已知功能，推斷并驗(yàn)證其是否與肉牛的肌內(nèi)脂肪沉積有關(guān)；或是根據(jù)脂肪形成的機(jī)制推斷可能與哪些基因有關(guān)，然后驗(yàn)證其是否與肉牛肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)。這些研究可以確定或排除某個(gè)基因是否與肉牛肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)，但大量理論上無(wú)法推測(cè)但與肌內(nèi)脂肪沉積有關(guān)的基因，卻可能永遠(yuǎn)沉睡在基因信息寶庫(kù)之中。此外，育肥場(chǎng)通常采用同一飼養(yǎng)方法育肥同一品種的肉牛，但得到的產(chǎn)品中大理石花紋差異巨大，這成為制約企業(yè)效益的重要因素。本研究使用全基因組重測(cè)序方法，分析了相同飼養(yǎng)條件但肌內(nèi)脂肪含量差異顯著的安格斯?！料嬷悬S牛雜交牛的基因多態(tài)性，在全基因組層次上探討了高肌內(nèi)脂肪含量和低肌內(nèi)脂肪含量肉牛的基因多態(tài)性差異，對(duì)基因進(jìn)行全面篩選，以尋找肌內(nèi)脂肪沉積能力的基因標(biāo)記；并通過(guò)生物信息學(xué)分析明確了同一品種肉牛在相同飼養(yǎng)條件下肌內(nèi)脂肪沉積能力不同的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石油醚為沸程30～60 ℃的分析純；基因提取試劑盒QIAGEN-DNeasy Blood & Tissue Kit-69504、切膠回收試劑盒QIAGEN-QIAquick Gel Extraction Kit-28706、基因片段純化試劑盒QIAquick PCR均購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；測(cè)序建庫(kù)試劑盒NEB-Next DNA Sample Prep Reagent Set 1-E6000L購(gòu)自美國(guó)NEB公司；其他所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Senven2Go pH計(jì)，德國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；SP62便攜式色差計(jì)，美國(guó)愛(ài)色麗科技有限公司；SER148索氏抽提儀，意大利VELP科技股份有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀，英國(guó)Stable Micro System公司；HiSeqTM 2500 高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用24月齡同期高能集中育肥的58頭安格斯?！料嬷悬S牛雜交牛進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。肉牛屠宰前運(yùn)到屠宰場(chǎng)，宰前禁食12 h，供應(yīng)飲水。肉牛擊暈后放血，按照標(biāo)準(zhǔn)工藝屠宰處理。測(cè)定肉牛生產(chǎn)性能，取背最長(zhǎng)肌樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后使用AOAC(1996)提供的方法測(cè)定樣品肌內(nèi)脂肪含量，選取脂肪含量最高的6頭牛和脂肪含量最低的6頭牛，測(cè)定其背最長(zhǎng)肌的品質(zhì)指標(biāo)。隨后對(duì)選定樣品進(jìn)行基因組重測(cè)序。

1.4 肉牛背最長(zhǎng)肌品質(zhì)測(cè)定

屠宰率為屠宰后胴體質(zhì)量與活畜宰前禁食24 h質(zhì)量的比值，即屠宰率/%=胴體重/活體重×100。背脂厚是指使用卡尺測(cè)定的12～13肋骨間脂肪的厚度(單位：cm)。

宰后24 h在肉牛右半胴體的12/13脊椎間(深3 cm)使用帶有固體探頭的便攜式pH計(jì)(SenvenGo, Mettler-Toledo)測(cè)定pH值，每個(gè)胴體測(cè)定3組pH值后取平均值。

使用AOAC (AOAC, 1996)方法測(cè)定磨碎后肌肉樣品的肌內(nèi)脂肪的百分含量。在105 ℃下烘干5 g(3個(gè)重復(fù))肌肉樣品至恒重，通過(guò)烘干前后的差值計(jì)算水分的百分含量。

測(cè)定剪切力的樣品在(2±2.0) ℃下解凍過(guò)夜，在(79±1.0) ℃下加熱，使用溫度計(jì)(AquaTuffTM351, Cooper-Atkins Corporation, USA)監(jiān)測(cè)牛排中心溫度至70 ℃，然后取出樣品在(2±2.0) ℃下過(guò)夜。順著肌纖維方向取9～12個(gè)直徑1.27 cm的圓柱，使用TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)分析儀搭配HDP/BSW探頭對(duì)肉柱的剪切力值進(jìn)行測(cè)定。剪切力值(單位：N)為每個(gè)樣品多個(gè)肉柱的平均值。

測(cè)定肉色時(shí)，先將真空包裝的牛肉打開(kāi)，在室溫暴露于空氣中發(fā)色30 min。使用Xrite-SP62便攜式色差計(jì)(光源選用D65，先使用黑白標(biāo)準(zhǔn)版校正)測(cè)定背最長(zhǎng)肌的肉色，每個(gè)樣品測(cè)定3次取平均值。肉色測(cè)定結(jié)果用國(guó)際照明委員會(huì)(CIE)的Lab顏色模式表示，L*值表示亮度，L*越大，牛肉亮度越高；a*值代表紅綠，a*值越大，牛肉顏色越紅；b*值代表黃藍(lán)，b*值越大，牛肉顏色越黃。

1.5 基因組重測(cè)序方法

以牛背最長(zhǎng)肌肌肉為研究對(duì)象進(jìn)行基因組重測(cè)序分析。實(shí)驗(yàn)流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)分析程序執(zhí)行，包括樣本制備試驗(yàn)和測(cè)序試驗(yàn)。簡(jiǎn)言之，提取檢測(cè)合格的樣品基因組DNA，用超聲波將DNA片段化，使用QIAquick PCR試劑盒純化，末端修復(fù)、3′端加A、連接測(cè)序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的文庫(kù)用Illumina HiSeqTM 2500進(jìn)行測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)序得到的原始雙端序列(reads)進(jìn)行數(shù)據(jù)評(píng)估，然后將reads序列與參考序列行比對(duì)，并基于比對(duì)結(jié)果進(jìn)行SNP、SV檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果對(duì)多態(tài)標(biāo)記分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并實(shí)現(xiàn)關(guān)聯(lián)分析、DNA水平差異基因挖掘和差異基因功能注釋等。

1.7 數(shù)據(jù)分析

性狀相關(guān)侯選區(qū)域的選擇通過(guò)兩組間的基因型頻率差異進(jìn)行篩選。本研究中2組樣品分別為高肌內(nèi)脂肪組和低肌內(nèi)脂肪組，使用Euclidean distance (ED) 關(guān)聯(lián)算法選擇候選區(qū)域，即通過(guò)計(jì)算兩組樣品間各突變型的頻率距離，采用距離差異來(lái)反映標(biāo)記與目標(biāo)區(qū)域的連鎖強(qiáng)度。本研究中2組樣品的分組核心標(biāo)準(zhǔn)為肌內(nèi)脂肪含量，2組樣品做關(guān)聯(lián)分析后得出的差異基因就是與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的基因。

ED的計(jì)算公式為：

(1)

式中: mut與wt分別表示突變型組與野生型組， A、 C、 G、 T表示標(biāo)記位點(diǎn)各突變型所占測(cè)序read的比例，對(duì)于二倍體來(lái)說(shuō)，大部分標(biāo)記只有2種突變型。

根據(jù)2組樣品間的SNP位點(diǎn)集及基因型的深度信息，計(jì)算2組樣品間的突變頻率差異，即ED值。為降低單個(gè)SNP位點(diǎn)計(jì)算帶來(lái)的偏差，對(duì)得到的結(jié)果進(jìn)行了擬合。閾值的選擇使用分位數(shù)方法，即對(duì)所有的擬合值從小到大排序，選擇大于 99%的SNP標(biāo)記ED值作為篩選閾值，每個(gè)性狀閾值不同。實(shí)際使用中，可以通過(guò)對(duì)ED值取指數(shù)的形式降低背景噪音，增加關(guān)聯(lián)區(qū)域的準(zhǔn)確性。

本研究選取ED值 6次方的擬合值(擬合時(shí)選擇window大小為 50kb)作為后續(xù)分析的ED值，選取 99%分位數(shù)的閾值為 0.98。

高脂肪組和低脂肪組間屠宰率、背脂厚、pH值、肌內(nèi)脂肪、水分含量、剪切力、L*、a*和b*的差異性分析使用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 背最長(zhǎng)肌品質(zhì)分析

對(duì)高肌內(nèi)脂肪組(high fat group, HFG)和低肌內(nèi)脂肪組(low fat group, LFG)肉牛的屠宰率、背脂厚以及背最長(zhǎng)肌pH值、肌內(nèi)脂肪、水分含量、剪切力、肉色L*、a*和b*進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明,HFG和LFG之間屠宰率、背脂厚、背最長(zhǎng)肌pH值、剪切力、肉色L*、a*和b*差異均不顯著(p>0.05)。HFG的脂肪含量顯著高于LFG，且HFG的水分含量顯著低于LFG(p<0.05)。

圖1 肉牛背最長(zhǎng)肌的牛肉品質(zhì)分析Fig.1 Quality analysis of Longissimus dorsi of beef cattle注：同一指標(biāo)標(biāo)注同一字母表示統(tǒng)計(jì)分析差異不顯著，標(biāo)注不同字母表示差異顯著(p<0.05)。屠宰率、肌內(nèi)脂肪、水分含量為百分含量(%)，背脂厚單位為厘米(cm)，剪切力單位為牛頓(N)。

2.2 基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析

2.2.1 測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

對(duì)高脂肪含量組和低脂肪含量組全基因組重測(cè)序所得到的reads進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 高脂肪含量組和低脂肪含量組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估Table 2 Data evaluation for sequence of the HFG andLFG groups

注：表中總reads指測(cè)序所得的所有reads數(shù)目；總堿基數(shù)指的是測(cè)序所得所有堿基數(shù)目；Q30(%)指的是平均質(zhì)量大于等于30的堿基占所有堿基的百分比；GC(%)指的是G和C的和占總堿基數(shù)目的百分比。

2.2.2 與參考基因組比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

高脂肪含量組和低脂肪含量組的比對(duì)結(jié)果如表3所示。本研究測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)果良好，2組樣品的比對(duì)率均達(dá)到80%以上，測(cè)序覆蓋率均達(dá)97%以上。

表3 高脂肪含量組和低脂肪含量組的比對(duì)結(jié)果Table 3 Mapping result of HFG and LFG groups

注：表中總reads數(shù)指過(guò)濾后得到的reads數(shù)目，雙端分別統(tǒng)計(jì)。比對(duì)百分?jǐn)?shù)(%)指比對(duì)上的reads數(shù)占所有測(cè)序reads數(shù)的百分比；測(cè)序深度指測(cè)序平均覆蓋深度；覆蓋率(%)指在基因組上的覆蓋率。

測(cè)序深度分布圖可以直觀反映樣品測(cè)序深度的分布情況。本研究對(duì)樣品測(cè)序深度進(jìn)行了估計(jì)并繪制了樣品深度分布圖(圖2，圖3)。

圖2 高脂肪含量組測(cè)序深度分布Fig.2 Sequencing depth distribution of high intramuscular fat content group

圖3 低脂肪含量組測(cè)序深度分布Fig.3 Sequencing depth distribution of low intramuscular fat content group

圖2為高脂肪含量組的測(cè)序深度分布圖，“■”表示為深度分布曲線(左坐標(biāo)軸)，反映各深度的堿基所占的比率，其峰值在7左右，即該樣品的平均測(cè)序深度為7X；“■”表示累積深度分布曲線(右坐標(biāo)軸)，反映深度值不低于給定深度的堿基所占的比率，其中1X以上深度的堿基比率為 98.45%，即1X深度以上的堿基覆蓋了基因組的98.45%。

圖3為低脂肪含量組的測(cè)序深度分布圖，該樣品的平均測(cè)序深度為7X；1X以上深度的堿基比率為 97.71%，即1X深度以上的堿基覆蓋了基因組的97.71%。

2.2.3 與參考基因組比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)結(jié)果，使用SAMtools進(jìn)行重復(fù)，使用GATK進(jìn)行局部重比對(duì)、堿基質(zhì)量值校正等處理后[7]，再使用GATK進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)檢測(cè)，過(guò)濾，并得到最終的SNP位點(diǎn)集。兩組樣品共檢測(cè)到9 920 320個(gè)SNP，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3 脂肪含量與基因多態(tài)性(SNP)的關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 高脂肪含量組和低脂肪含量組SNP分析

根據(jù)SNP的檢測(cè)結(jié)果，篩選高脂肪含量組和低脂肪含量組間有差異的堿基位點(diǎn)(兩組間不一致或?yàn)殡s合型的SNP位點(diǎn))，并確定SNP在基因組中的位置，以及是否引起基因的非同義突變，從而影響編碼的蛋白序列。高脂肪含量組和低脂肪含量組的SNP統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表5。

表4 檢測(cè)得到的SNP結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistical results of SNP

注：轉(zhuǎn)換個(gè)數(shù)：多態(tài)性位點(diǎn)中轉(zhuǎn)換的個(gè)數(shù)；顛換個(gè)數(shù)：多態(tài)性位點(diǎn)中顛換的個(gè)數(shù)；轉(zhuǎn)換/顛換：轉(zhuǎn)換和顛換的比率。

表5 高脂肪含量組和低脂肪含量組差異SNP統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 5 Statistical result of different SNP between HFGand LFG

2.3.2 脂肪含量與基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析

選擇99%閾值線以上的區(qū)域?yàn)榕c性狀相關(guān)的侯選區(qū)域，去掉區(qū)域大小小于50 kb長(zhǎng)度的關(guān)聯(lián)結(jié)果，共得到 221個(gè)區(qū)域，總長(zhǎng)度為 21 345 340 bp，其中包含非同義突變SNP位點(diǎn)的基因共 26 個(gè)(見(jiàn)表6)。這些基因就是牛背部肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的基因。

表6 肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)基因的基本信息Table 6 Basic information of the genes related to IMFdeposition

續(xù)表6

注：1代表蛋白質(zhì)編碼(protein coding);2代表假性基因(pseudo gene)。

2.3.3 脂肪關(guān)聯(lián)基因的GO注釋

對(duì)關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行GO功能注釋，按照細(xì)胞組成(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物過(guò)程(biological process)對(duì)基因進(jìn)行分類。GO分類統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖4(統(tǒng)計(jì)到二級(jí)功能)。

差異基因功能涉及的細(xì)胞組成部位涉及細(xì)胞器(organelle)、細(xì)胞膜(membrane)、胞外區(qū)(extracellular region)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)、大分子復(fù)合物(macromolecular complex)、膜封閉的內(nèi)腔(membrane-enclosed lumen)和細(xì)胞連接部分(cell junction)；涉及的分子功能是結(jié)合(binding)、催化活性(catalytic activity)、分子傳感器活性(molecular transducer activity)、受體活性(receptor activity)、結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)、電子轉(zhuǎn)運(yùn)活性(electron carrier activity)；涉及的生物學(xué)途徑有細(xì)胞過(guò)程(cellular process)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、代謝過(guò)程(metabolic process)、對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)(response to stimulus)、多細(xì)胞的生物過(guò)程(multicellular organismal process)、信號(hào)(signaling)、免疫系統(tǒng)過(guò)程(immune system process)、發(fā)育過(guò)程(developmental process)、多有機(jī)體過(guò)程(multi-organism process)、細(xì)胞組分組織與起源(cellular component organization or biogenesis)、死亡(death)、定位(localization)、定位的建立(establishment of localization)、復(fù)制(reproduction)、殺死細(xì)胞(cell killing)、生殖過(guò)程(reproductive process)、轉(zhuǎn)運(yùn)(locomotion)、生物黏附(biological adhesion)和生長(zhǎng)(growth)。

圖4 與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)基因的GO注釋Fig.4 GO Function classification of genes related to IMF deposition

3 討論

3.1 肉牛生產(chǎn)性能和背最長(zhǎng)肌品質(zhì)分析

為了分析影響脂肪的關(guān)鍵基因，在實(shí)驗(yàn)樣品選擇時(shí)，以肉牛背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量作為核心選擇指標(biāo)，共選擇12頭牛分成高脂肪含量組和低脂肪含量組，每組6頭牛。由圖5可知，2組樣品之間肌內(nèi)脂肪差異較大。同時(shí)分析屠宰率、背脂厚、水分含量、pH值、剪切力、L*、a*和b*等肉牛生產(chǎn)性能指標(biāo)、牛肉品質(zhì)指標(biāo)。牛肉水分含量與脂肪含量成負(fù)相關(guān)，這被認(rèn)為是脂肪替代了水分導(dǎo)致的[8]。除水分含量外，高脂肪含量組與低脂肪含量組間其他品質(zhì)沒(méi)有顯著差異。這種樣品選擇的結(jié)果保證了肉?；蚨鄳B(tài)性主要涉及肉牛肌內(nèi)脂肪，為分析肌內(nèi)脂肪沉積機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

圖5 高低肌內(nèi)脂肪組背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量Fig.5 Intramuscular fat content of Longissimusdorsi in HFG and LFG groups

DERINGTON等研究認(rèn)為，隨著USDA牛肉等級(jí)的提高，肌內(nèi)脂肪含量提高，牛肉的剪切力降低[9]。UEAD等認(rèn)為牛肉的剪切力與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)[8]。然而，本研究結(jié)果表明肌內(nèi)脂肪含量對(duì)牛肉的剪切力沒(méi)有顯著影響，這與LIANG等研究結(jié)果中牛肉肌內(nèi)脂肪含量從7.7% 增加到 17.4%對(duì)剪切力沒(méi)有影響的結(jié)果一致[10]。這表明同一品種肉牛在相同飼養(yǎng)條件下，肌內(nèi)脂肪對(duì)剪切力沒(méi)有顯著影響，DERINGTON和UEAD研究中隨著肌內(nèi)脂肪含量提高剪切力降低可能是由其他因素導(dǎo)致的。

3.2 測(cè)序結(jié)果的質(zhì)量分析

測(cè)序結(jié)果的質(zhì)量是后續(xù)研究分析的根本保證，也直接影響分析的準(zhǔn)確性。從本研究的測(cè)序質(zhì)量上看，比對(duì)率、覆蓋率以及測(cè)序深度等結(jié)果均顯示測(cè)序結(jié)果非?？煽?，與國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究項(xiàng)目的測(cè)序質(zhì)量相比，本研究的測(cè)序結(jié)果質(zhì)量較高。

本研究中2組樣品的比對(duì)率均達(dá)到80%以上，稍低于日本學(xué)者對(duì)鹿兒島牛進(jìn)行全基因組重測(cè)序時(shí)85%的比對(duì)率[11]。覆蓋率高意味著SNP發(fā)掘時(shí)能發(fā)現(xiàn)更多可靠的SNP位點(diǎn)，能檢測(cè)出更多的變異。本研究中2組樣品的測(cè)序覆蓋率均達(dá)97%以上，大大高于日本學(xué)者對(duì)鹿兒島牛進(jìn)行全基因組測(cè)序時(shí)93%的覆蓋率[11]和全球?；蚪M測(cè)序分析協(xié)會(huì)研究中92%的覆蓋率[12]。日本學(xué)者對(duì)鹿兒島牛進(jìn)行測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)630萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)[11]，與本研究的結(jié)果相似。然而，有研究?jī)H檢測(cè)到244萬(wàn)個(gè)牛的SNP位點(diǎn)[13]，比本研究結(jié)果少，其原因可能是本研究中牛品種是安格斯×湘中黃牛雜交牛，雜交提高了基因的多態(tài)性。測(cè)序深度是由測(cè)序量決定的，可以人為地設(shè)計(jì)并實(shí)施。在牛的全基因組重測(cè)序中使用的測(cè)序深度有7.3X[14]、7.4X[15]、 15.8X[11]等，本研究綜合考慮各方面因素，最終決定采取7X的測(cè)序深度，7X的測(cè)序深度足夠滿足本研究的要求，同時(shí)經(jīng)濟(jì)性較高。

3.3 影響肌內(nèi)脂肪沉積的機(jī)制分析

本研究最終確定了26個(gè)與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的基因，通過(guò)分析總結(jié)，下面分為4個(gè)方面進(jìn)行討論：

第一類是與能量代謝和酶有關(guān)的基因，分別有ADRA1A、GSTA3、GSTA5和CTSG。ADRA1A基因?yàn)槟I上腺素α-1A受體基因，最直接的功能是編碼腎上腺素α-1A受體蛋白，與能量代謝相關(guān)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖的攝入影響脂肪的形成[16]。GSTA3和GSTA5是谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶編碼基因[17-18]，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶與線粒體功能相關(guān)，影響到能量代謝[19]，最終影響肌內(nèi)脂肪的沉積。CTSG是組織蛋白酶G的編碼基因[20]。已知組織蛋白酶體系中多個(gè)酶與脂肪形成相關(guān)，如組織蛋白酶K與動(dòng)物葡萄糖代謝、體重增加和脂肪含量相關(guān)[21]，溶酶體蛋白酶L可以調(diào)控脂肪形成[22]，因此組織蛋白酶K可能在肉牛肌內(nèi)脂肪沉積過(guò)程起重要作用。上述基因直接影響肉牛的能量代謝能力，因此相同品種的肉牛個(gè)體間不同的能量代謝水平是導(dǎo)致肉牛肌內(nèi)脂肪沉積能力不同的重要原因。

第二類是消化吸收相關(guān)基因，包括LOC508858和LOC786126。LOC508858[23]與LOC786126[15]是編碼十二指腸酶的基因，與消化吸收有關(guān)。因此，相同品種的肉牛個(gè)體間不同的消化吸收能力影響肉牛肌內(nèi)脂肪的沉積能力。

第三類是脂肪形成和調(diào)節(jié)相關(guān)酶的基因，包括FUT10、AOX1和CLEC4F。FUT10編碼黑角藻糖基轉(zhuǎn)移酶，黑角藻糖基轉(zhuǎn)移酶能催化核苷二磷酸巖藻糖將巖藻糖基轉(zhuǎn)移至一種糖、糖蛋白或糖脂分子[24]，還參與胚胎發(fā)育過(guò)程中的器官分化、造血細(xì)胞的分化和干細(xì)胞維持[25]，基于FUT10多態(tài)性的不同可以推測(cè)不同肉牛個(gè)體間脂肪沉積能力差異在胚胎期可能就已形成。AOX1基因是乙醛氧化酶-1基因，屬鉬黃素蛋白家族，可以通過(guò)破壞脂肪生成和脂聯(lián)素的釋放影響動(dòng)物脂肪的形成[26-27]。CLEC4F是C型凝集素家族中的一員，是一種高度親和半乳糖等糖類的蛋白質(zhì)，在調(diào)節(jié)糖脂代謝中起重要作用[28]。

第四類非常有趣，是嗅覺(jué)受體相關(guān)的基因，共5個(gè)，分別是LOC100301297、LOC508626、LOC511626、LOC788554和LOC788573。這5個(gè)基因功能相似，均為編碼嗅覺(jué)受體蛋白的基因。LOC100301297主要功能是編碼8D2嗅覺(jué)受體蛋白[29]，LOC508626編碼2G2嗅覺(jué)受體蛋白[30]，LOC511626編碼2J3嗅覺(jué)受體蛋白[31]，LOC788554編碼嗅覺(jué)受體蛋白家族8蛋白[32]，LOC788573是編碼嗅覺(jué)受體olr1242蛋白的基因[33]。牛的嗅覺(jué)非常靈敏，是牛鑒定、選擇食物的重要方式[34]，并影響牛的食欲[35]。牛的嗅覺(jué)基因具有差異性[36]，而上述牛嗅覺(jué)基因的多態(tài)性可能是影響肉牛食欲并最終影響肉牛肌內(nèi)脂肪沉積的重要原因。

4 結(jié)論

高脂肪含量組背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量顯著高于低肌內(nèi)脂肪含量組(p<0.05)，脂肪含量的提高伴隨著水分含量的顯著降低(p<0.05)，兩組間其他品質(zhì)差異不顯著(p>0.05)。通過(guò)對(duì)高脂肪含量組和低脂肪含量組肉牛肌肉的高通量全基因組重測(cè)序，并進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢測(cè)，進(jìn)而對(duì)兩個(gè)組間的SNP位點(diǎn)與肌內(nèi)脂肪含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，最終篩選得到26個(gè)主要差異基因。對(duì)這26個(gè)基因進(jìn)行基因注釋，結(jié)果表明，差異基因涉及多個(gè)細(xì)胞組成部位，6類分子功能，19個(gè)生物學(xué)過(guò)程。這充分表明了肉牛肌內(nèi)脂肪沉積基因調(diào)控的復(fù)雜性。差異表達(dá)的26個(gè)基因涉及肉牛的能量代謝、消化吸收、脂肪形成和嗅覺(jué)受體相關(guān)的基因。由嗅覺(jué)差異導(dǎo)致的肉牛食欲差異、能量代謝和消化吸收能力不同，以及肉牛個(gè)體間不同的脂肪形成能力導(dǎo)致同一品種肉牛在相同的飼養(yǎng)條件下肌內(nèi)脂肪的含量不同。本研究為肉牛肌內(nèi)脂肪調(diào)控奠定了的基礎(chǔ)，指出了研究方向。