熱凝膠在堿溶過程的流變學(xué)和質(zhì)構(gòu)學(xué)行為分析

葉劍，鄭志永，詹曉北，蔣蕓

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

熱凝膠(curdlan)又稱凝膠多糖、可德蘭膠、可得然膠等，是一種由微生物產(chǎn)生的胞外多糖，分子內(nèi)以β-1,3-糖苷鍵連接而成，具有加熱成膠的獨特特性[1-2]，本研究采用最為貼切的熱凝膠為名。熱凝膠分子通常以右手三螺旋結(jié)構(gòu)存在，具有熱成膠性、抗脫水性及抗凍融性等特點[3]。1996年，熱凝膠多糖獲美國FDA批準(zhǔn)成為一種食品添加劑[4]，現(xiàn)在，熱凝膠多糖已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，主要作為凝膠劑、結(jié)構(gòu)改性劑、持水劑、黏合劑、增稠劑等用于果凍、肉產(chǎn)品、低熱量食品等的制作[5-6]。WEST和SALAH等[7-10]研究了以不同原料為底物發(fā)酵生產(chǎn)熱凝膠。本實驗室對熱凝膠發(fā)酵和提取工藝做了深入的研究[11-12]，分析了熱凝膠合成的機理，對生產(chǎn)熱凝膠的菌株進行了育種和篩選[13-16]。

在熱凝膠提取過程中，發(fā)酵液中菌體和熱凝膠都是水不溶性物質(zhì)[17]，相互黏附，密度差小，粒徑微小，屬固-固分離，分離難度大。熱凝膠可溶解在二甲亞砜[18]和NaOH溶液[19]等堿性溶劑中，提取過程中一般先將熱凝膠溶于堿溶液中形成溶膠，使固-固分離轉(zhuǎn)變成固-液分離，降低分離難度。堿溶后的熱凝膠形成高黏度的溶膠，通過壓濾等手段將膠液中的菌體分離去除，因此溶膠體系黏度的大小等流變性質(zhì)是影響分離難易度的重要因素。與此同時，堿對熱凝膠產(chǎn)品品質(zhì)有損傷作用[17]，同時強堿對菌體有裂解作用，釋放出雜質(zhì)，因此堿溶處理方式影響產(chǎn)品的純度和質(zhì)量；若溶解不徹底，除菌時易堵塞過濾設(shè)備，影響分離效率。因此需要對堿溶過程中熱凝膠的流變學(xué)、堿溶過程對熱凝膠產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)學(xué)的影響等開展研究。本研究主要集中于分析熱凝膠溶解于堿液過程中的顆粒形態(tài)、流變學(xué)及質(zhì)構(gòu)學(xué)性質(zhì)，探尋在不同處理方式下適用于工業(yè)提取熱凝膠的方法，為熱凝膠工業(yè)化提取提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熱凝膠發(fā)酵產(chǎn)物，實驗室通風(fēng)發(fā)酵所得[20]；食品級熱凝膠，購自日本麒麟公司；NaOH、HCl：分析純，上海國藥集團。

1.2 儀器與設(shè)備

Haake Mars Ⅲ流變儀，美國賽默飛世爾科技；MD-NJ-5凝膠強度測定儀，臨安豐源電子有限公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國SMS公司；離心機，德國Sigma公司；組合式搖床，上海國強生化有限公司；HHS恒溫水浴鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 熱凝膠的處理方法

熱凝膠一部分來源于實驗室通風(fēng)發(fā)酵所得，為發(fā)酵原液，含有土壤桿菌菌體，用于觀察熱凝膠溶解狀態(tài)；另一部分熱凝膠購自日本麒麟公司，是提取過后的食品級產(chǎn)品。取5 g食品級熱凝膠置于500 mL錐形瓶，加入50 mL去離子水充分混勻，稱取配制成實驗要求堿濃度(0.2～1.0 mol/L)所需的NaOH，溶于200 mL去離子水中，待冷卻后加入錐形瓶中。按照下文所述單因素實驗設(shè)計條件將錐形瓶置于回旋式搖床振蕩溶解，溶解后取溶膠在流變儀中進行流變學(xué)分析，剩余溶膠滴加0.5 mol/L HCl溶液攪拌中和，使pH達(dá)到7.0，熱凝膠析出，8 000 r/min、10 min離心洗滌3次，收集離心物得到熱凝膠濕膠，用于后續(xù)質(zhì)構(gòu)分析。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

1.3.2.1 溶解時間

以實驗室發(fā)酵產(chǎn)物為原料，取50 mL含有土壤桿菌的發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min得到沉淀物，將沉淀物振蕩(200 r/min，30 ℃)溶解于50 mL濃度為0.25 mol/L的堿溶液中，每隔30 min取樣，滴加數(shù)滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的苯胺藍(lán)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%中性紅混合染色液，混勻染色3 min，通過光學(xué)顯微鏡觀察熱凝膠是否充分溶解。

1.3.2.2 堿處理時間

以市售熱凝膠為原料，按1.1方法將熱凝膠與NaOH溶液混合，配制成熱凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、NaOH終濃度為0.5 mol/L的體系，于30 ℃、200 r/min條件下分別回旋振蕩0.5、1、2、4、6 h，取溶膠進行穩(wěn)態(tài)流變學(xué)分析，提取所得熱凝膠進行質(zhì)構(gòu)分析。

1.3.2.3 堿溶溫度

以市售熱凝膠為原料，按1.1方法將熱凝膠與NaOH溶液混合，配制成熱凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、NaOH終濃度為0.5 mol/L的體系，置于恒溫水浴鍋中200 r/min回旋振蕩2 h，水浴溫度分別設(shè)置為15、20、25、30、35、40 ℃。對樣品進行穩(wěn)態(tài)流變學(xué)和質(zhì)構(gòu)分析。

1.3.2.4 堿濃度

以市售熱凝膠為原料，將熱凝膠與NaOH溶液混合，配制成熱凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，NaOH終濃度分別為0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.7、1 mol/L的體系，于30 ℃、200 r/min條件下回旋振蕩2 h，取溶膠進行進行流變學(xué)分析，提取所得熱凝膠進行質(zhì)構(gòu)分析。

1.3.3 熱凝膠質(zhì)構(gòu)分析

1.3.3.1 凝膠強度測定與分析

取5 g熱凝膠濕膠放在烘干并精確稱重后的錫箔紙上，105 ℃烘至恒重后稱量，計算濕膠與干膠重量比，分析其含水率。取15 g熱凝膠濕膠，根據(jù)其含水率補充或高速離心去除部分水使其熱凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 28304—2012[21]所述方法測定熱凝膠的凝膠強度。采用MD-NJ-5凝膠強度測定儀分析凝膠強度，探頭為圓柱形探頭，平端面積1 cm2。樣品截面積大于探頭面積，穿刺模式，測試前速度1 mm/s，測試時速度為1 mm/s，測試后速度為1 mm/s，得到破裂曲線，根據(jù)負(fù)荷-時間曲線計算凝膠強度，凝膠強度按公式(1)計算：

W=F/A

(1)

式中：W，凝膠強度，g/cm2；F，凝膠破裂時曲線急劇下降拐點的力，g；A,探頭末端平面面積，cm2。

1.3.3.2 凝膠樣品全質(zhì)構(gòu)分析(texture profile analysis, TPA)

采用TA.XT plus質(zhì)構(gòu)分析儀的壓縮模式測定熱凝膠的機械性能。探頭型號為P/0.5R，測試前速度1 mm/s，測試時速度為1 mm/s，測試后速度為1 mm/s，目標(biāo)模式為應(yīng)變，壓縮形變量為50%，測試時間5 s，觸發(fā)力為10 g，得到全質(zhì)構(gòu)曲線。實驗質(zhì)構(gòu)分析參數(shù)[22-23]有：(1)硬度，第一次壓縮循環(huán)的最大值。(2)黏性：模擬用以克服探頭與樣品表面間吸引力所必需的工作，是第一次循環(huán)測試曲線在橫坐標(biāo)下方的面積。(3)內(nèi)聚性：模擬樣品內(nèi)部粘合力，樣品經(jīng)壓縮變形后對再次壓縮的相對抵抗力，內(nèi)聚性=第二次壓縮面積/第一次壓縮面積。(4)彈性：變形樣品去除變形力后恢復(fù)至原高度或體積的比率。(5)咀嚼性：模擬將固體樣品咀嚼成可吞咽狀態(tài)所需的能量，咀嚼性=硬度×內(nèi)聚性×彈性。(6)回復(fù)性：變形樣品在導(dǎo)致變形相同的速度、壓力作用下的回復(fù)程度，回復(fù)性=回復(fù)面積/壓縮面積。

1.3.4 溶膠流變學(xué)分析

1.3.4.1 穩(wěn)態(tài)流變學(xué)分析

經(jīng)過堿溶處理后得到的熱凝膠溶膠，采用Haake Mars III流變儀進行穩(wěn)態(tài)流變學(xué)實驗。實驗溫度25 ℃，轉(zhuǎn)子型號C60/1° Ti L，間隙d=0.052 mm，剪切速率0.1～100 1/s。通過剪切應(yīng)力(τ)與剪切速率(γ)之間關(guān)系的曲線來判斷流體流變模型。流體的簡單流動行為可表示為[24]：

τ=τy+Kγn

(2)

式中：τ為剪切應(yīng)力，Pa；τy為屈服應(yīng)力張量，牛頓流體、冪律流體τy值為0，賓漢塑性流體τy大于0，只有在應(yīng)力超過屈服點時，流體出現(xiàn)流動，在屈服前，流體實際是彈性固體；K為流體的稠度系數(shù)，數(shù)值與液體的稠度和濃度有關(guān)，K越大，流體越黏，即流動阻力越大，mPa·sn；γ為剪切速率，1/s；n為流動指數(shù)，n的大小表示流體偏離牛頓流體的程度，當(dāng)n=1，流體為牛頓流體，當(dāng)n>1，流體為脹塑性流體，當(dāng)0

1.3.4.2 動態(tài)流變學(xué)

在動態(tài)模式測定前，需確定樣品的線性黏彈性范圍，實驗溫度25 ℃，轉(zhuǎn)子型號P60 Ti L，間隙d=1 mm，頻率f=1 Hz，應(yīng)變λ=0.01%～100%進行檢測。確定線性黏彈區(qū)后進行動態(tài)流變學(xué)分析，采用頻率掃描模式，轉(zhuǎn)子型號P60 Ti L，間隙d=1 mm，應(yīng)變λ根據(jù)線性黏彈區(qū)范圍來選擇，頻率f=0.1～100 Hz。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿處理時間對熱凝膠的影響

熱凝膠和菌體混合懸濁液在堿溶前，如圖1-a所示，熱凝膠形成晶狀顆粒，顆粒聚集成團塊，染色后呈暗紅色，熱凝膠顆粒長徑約15～25 μm，短徑約10～12 μm，菌體被包裹和固定在半透明的熱凝膠顆粒內(nèi)或表面；0.25 mol/L NaOH溶液中堿溶30 min后懸濁液中顆粒物明顯變小，呈橙黃色，顯微鏡下可見更多游離的土壤桿菌菌體，熱凝膠顆粒長徑減至約2～4 μm，短徑減至約1～2 μm；堿溶60 min后，顯微鏡下只能觀察到桿狀的土壤桿菌菌體，染色程度較淺，菌體呈游離狀，可以判斷為熱凝膠顆粒完全溶解，因此堿溶時間初選為60 min，在后續(xù)的實驗中利用顯微鏡跟蹤觀察熱凝膠的溶解狀況。

圖1 堿處理不同時間后熱凝膠顆粒變化(放大倍數(shù)100×16)Fig.1 Curdlan particles changed after different time of alkali treatment (scale up 100×16)

堿溶后熱凝膠溶膠的穩(wěn)態(tài)流變學(xué)分析結(jié)果如圖2所示，堿處理0.5 h時熱凝膠尚未完全溶解，樣品中存在固體顆粒，相比較于處理1 h后樣品，流體黏度值(η)倍增，稠度系數(shù)K高37%，流體流動性弱，流動指數(shù)n約為0.92，表現(xiàn)出非牛頓流體的特性。堿處理1 h后，熱凝膠完全溶解，處理1～6 h的溶膠流體黏度曲線線型較為一致，與處理0.5 h黏度曲線有較明顯區(qū)別，這表明熱凝膠溶解前后其流變學(xué)性質(zhì)會發(fā)生變化，處理1 h以上黏度曲線線型一致也從側(cè)面說明1 h后熱凝膠完全溶解。熱凝膠完全溶解后，熱凝膠分子間氫鍵不斷被破壞[19]，其流體稠度系數(shù)隨時間增加而線性下降，表現(xiàn)為流體黏度的下降，流動指數(shù)n在0.94～0.97之間，流體接近于牛頓型流體。

溶膠按方法1.1處理得到熱凝膠濕膠，按1.3所述方法分析其凝膠強度，結(jié)果如圖2-b中所示，在6 h以內(nèi)，堿處理時間對熱凝膠凝膠強度無影響。

圖2 不同堿處理時間熱凝膠黏度、n、K和凝膠強度變化Fig.2 Changes of viscosity, n, K and gel strength of curdlan at different alkali treatment time

在熱凝膠的工業(yè)提取過程中，不僅要關(guān)注產(chǎn)品質(zhì)量，同時還要考慮到工作效率及經(jīng)濟成本，在凝膠強度損失不大的情況下，溶膠黏度是選擇堿處理時間的重要指標(biāo)，黏度越低，除菌時越容易，對設(shè)備要求越低，但處理時間過長影響提取效率，因此堿溶時間建議選擇2～4 h。

2.2 堿溶溫度對熱凝膠的影響

在不同溫度下對熱凝膠進行處理，其流變學(xué)結(jié)果如圖3所示，溶膠黏稠度隨處理溫度的升高而降低，溶膠流動指數(shù)n隨溫度基本不變，流體接近于牛頓流體。NaOH具有強烈的氫鍵破壞能力，熱凝膠溶解在堿溶液中以后，熱凝膠分子中由氫鍵連接而形成的有序結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致了其宏觀理化性質(zhì)的變化，溫度的升高加劇了堿液對熱凝膠分子間氫鍵的破壞。

圖3 不同堿溶溫度處理對熱凝膠的影響Fig.3 Effect of different alkali solution temperature on curdlan

對熱凝膠樣品進行質(zhì)構(gòu)分析，結(jié)果如圖3、圖4所示。隨著處理溫度的提高，熱凝膠的凝膠強度、硬度和咀嚼性有所下降，較低溫度下堿液對熱凝膠結(jié)構(gòu)的破壞作用[11]較小，提高溫度處理后其對熱凝膠結(jié)構(gòu)的破壞性加?。粡椥?、內(nèi)聚性和回復(fù)性變化不大，說明樣品凝膠化后，在壓縮未破裂時組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；實驗所測樣品黏性>內(nèi)聚性，熱凝膠樣品組織間結(jié)合力小于凝膠表面吸引力，在探頭上升過程中有部分殘渣黏附在探頭上。

堿溶溫度升高，溶膠黏度下降，有利于過濾提取，但熱凝膠凝膠強度、硬度等質(zhì)構(gòu)性質(zhì)下降，降低了熱凝膠的品質(zhì)，在提取成本可接受范圍內(nèi)應(yīng)降低處理溫度以保證產(chǎn)品質(zhì)量。工業(yè)提取過程中，設(shè)備一般在室溫工作或水冷降溫，工作時機械摩擦?xí)?dǎo)致溫度升高，為節(jié)約成本，堿溶在室溫進行，若溫度過高，則水冷降溫控制在20～30 ℃之間。

圖4 不同溫度處理熱凝膠固體樣品全質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果Fig.4 Results of TPA of curdlan solid samples treated with different temperature

2.3 堿濃度對熱凝膠的影響

用不同濃度堿處理熱凝膠，實驗結(jié)果如圖5所示。從圖5-a、5-b可以看出，熱凝膠均質(zhì)后未加入NaOH時，體系中存在顆粒性物質(zhì)，流變學(xué)分析時剪切力大，黏度值高，均質(zhì)液屬于賓漢塑性流體，屈服應(yīng)力張量τy=8 Pa，需要對其施加高于τy的屈服力流體才表現(xiàn)出流動性。

★-0 mol/L NaOH; □-0.2 mol/L NaOH;○-0.25 mol/L NaOH;△-0.3 mol/L NaOH;▽-0.35 mol/L NaOH;◇-0.4 mol/L NaOH圖5 不同減濃度下熱凝膠溶膠流變學(xué)分析結(jié)果Fig.5 Rheology analysis results of curdlan sol at different alkali concentrations

均質(zhì)液流體的彈性模量G′大于黏性模量G″，隨著掃描頻率f增大，G′變化平緩，G″緩慢增加，體系中以彈性成分為主，表現(xiàn)為凝膠的特征。隨著堿濃度的增高，熱凝膠完全溶解,樣品G″>G′，體系中以黏性成分為主，表現(xiàn)為液體的特征，熱凝溶膠黏度不斷下降，流體從賓漢塑性流體向牛頓流體轉(zhuǎn)變。當(dāng)堿濃度小于0.3 mol/L時，堿溶液黏度值較高，堿濃度對溶液流變學(xué)性質(zhì)影響程度較大，土壤桿菌分泌的熱凝膠天然構(gòu)象呈三螺旋構(gòu)象[25]，分子剛性大，三螺旋構(gòu)象相互締合形成凝膠晶格，表現(xiàn)出膠凝性。熱凝膠分子在低濃度堿溶液(<0.3 mol/L)的作用下，螺旋之間的氫鍵被打斷，熱凝膠分子從三螺旋逐漸被解鏈成單鏈螺旋，分子鏈剛性下降，溶膠表現(xiàn)出黏性。當(dāng)堿濃度高于0.3 mol/L時，熱凝膠分子內(nèi)的氫鍵被進一步打斷，構(gòu)象繼續(xù)發(fā)生變化，單鏈螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)變成隨意盤曲的松散構(gòu)象，分子締合度隨堿濃度增加而降低[19]，流體黏度值降低，不同堿濃度溶膠的流變學(xué)性質(zhì)基本一致，此時堿濃度的增加對溶膠流變學(xué)性質(zhì)的影響趨于不變。

將經(jīng)過不同濃度堿處理得到的熱凝膠提取，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的熱凝膠，凝膠化后進行質(zhì)構(gòu)分析。熱凝膠的解螺旋現(xiàn)象類似于蛋白質(zhì)的變性過程，隨著堿濃度的增加，三螺旋構(gòu)象被解體，形成無規(guī)則卷曲的線性分子。當(dāng)加入酸中和后，三螺旋構(gòu)象得到恢復(fù)，但不能完全恢復(fù)至天然狀態(tài)，因此導(dǎo)致凝膠強度的損失。如圖6和圖7所示，熱凝膠凝膠強度隨堿濃度的增加線性降低，強度下降幅度高于溫度對強度的影響，說明堿濃度對于凝膠強度的影響要大于溫度對其的影響，應(yīng)盡量選擇較低的堿濃度處理。

圖6 不同堿濃度處理后熱凝膠凝膠強度Fig.6 Gel strength of curdlan treatment with different alkali concentrations

圖7 不同堿濃度處理熱凝膠固體樣品全質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果Fig.7 Results of TPA of curdlan solid samples treated with different alkali concentrations

隨著堿濃度的增大，熱凝膠的硬度和咀嚼性都有所下降；而其彈性、內(nèi)聚性和回復(fù)性變化不大，組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。實驗所測樣品黏性>內(nèi)聚性，組織間結(jié)合力小于凝膠表面吸引力，其各項指標(biāo)變化與溫度對其影響變化一致，說明無論是溫度還是堿濃度，對于熱凝膠凝膠內(nèi)部穩(wěn)定性的影響都較小。

堿濃度對熱凝膠的品質(zhì)和溶膠的黏度影響均較大，堿濃度高(>0.5 mol/L)時溶膠黏度低，有利于工業(yè)提取處理，但會大幅度降低熱凝膠的品質(zhì)，同時消耗大量的堿，造成資源浪費。堿濃度低(<0.3 mol/L)時有利于保護熱凝膠，但溶膠黏度大，增加分離提取難度，降低處理效率。綜合考慮處理效率、成本、產(chǎn)品質(zhì)量等因素，工業(yè)提取選擇0.3～0.5 mol/L的堿液終濃度較為合適。

3 結(jié)論

本研究考察了熱凝膠提取過程中的3個主要影響因素，通過分析樣品的流變學(xué)及質(zhì)構(gòu)學(xué)性質(zhì)，選擇適合工業(yè)堿溶提取熱凝膠的條件。結(jié)果表明，(1)溶膠黏度隨堿處理時間延長而降低，溶膠接近于牛頓型流體，凝膠強度基本不變。(2)熱凝膠凝膠強度和溶膠黏度均隨堿溶溫度升高的而下降，較高的溫度處理會降低熱凝膠的品質(zhì)，室溫或水冷環(huán)境下可以滿足工業(yè)要求。(3)隨著堿濃度的增加，流體從賓漢塑性流體向牛頓流體轉(zhuǎn)變。堿濃度低于0.3 mol/L時堿濃度增加溶膠流體性質(zhì)變化大，堿濃度高于0.5 mol/L時堿濃度增加熱凝膠品質(zhì)影響變化大。