黑曲霉單寧酶TahA的克隆表達(dá)和酶學(xué)特性解析

李夢迪，張志萌，董自星，田康明，金鵬，劉曉光，王正祥,

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津,300457) 2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院生物化工系，天津,300457)

單寧酶，即單寧?；饷?EC 3.1.1.20)，可專一性水解沒食子酰單寧及復(fù)合單寧等水解型單寧的酯鍵和縮酚羧鍵，生成葡萄糖、沒食子酸、六羥基聯(lián)苯二甲酸及醇類等物質(zhì)[1-2]。它是一種由單寧酸、五倍子等誘導(dǎo)產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶，也是一種細(xì)胞膜結(jié)合酶，可分泌至胞外[3]。單寧酶因其對單寧類物質(zhì)的高效水解作用而應(yīng)用于食品、飲料、釀酒、醫(yī)藥及化工等多個領(lǐng)域，其中以飲料和醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用最為廣泛[2]。隨著單寧酶在茶飲料和沒食子酸生產(chǎn)中的應(yīng)用不斷深入，加速了單寧酶的開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)。然而，單寧酶的大規(guī)模生產(chǎn)受到了許多因素的限制，包括酶學(xué)性質(zhì)研究的缺乏和較高的生產(chǎn)成本等[1, 4]。

除了存在于富含單寧的植物中，單寧酶還廣泛存在于微生物中，包括細(xì)菌、酵母和真菌等。目前產(chǎn)單寧酶的微生物主要是細(xì)菌以及真菌類的曲霉屬、青霉屬和根霉屬，尤其是曲霉屬中的黑曲霉和米曲霉[4-5]。單寧酶的生產(chǎn)可采用固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵2種方式。目前，單寧酶的生產(chǎn)主要是通過液體深層發(fā)酵獲得，其酶活較低，且酶液中成分復(fù)雜，難以純化，限制了單寧酶的應(yīng)用[6]。近年來，分子克隆技術(shù)的快速發(fā)展，為微生物單寧酶酶學(xué)性質(zhì)的研究和大規(guī)模生產(chǎn)提供了有效的途徑。

迄今為止，黑曲霉單寧酶已被克隆、表達(dá)或進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究的有以下5種：單寧酶Tan7[1, 7]、A.nigerGH1單寧酶[8-9]、A.nigerN5-5單寧酶[10-11]、A.nigerPTCC 5012單寧酶[12]以及具有β-葡萄糖苷酶活性的單寧酶[13]。本課題組前期通過對黑曲霉基因組中的單寧酶基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的編碼基因tahA。為此，本研究擬采用分子克隆的手段將其在畢赤酵母中進(jìn)行克隆表達(dá)，對其進(jìn)行初步純化后，全面解析該酶的生化特征，以期大規(guī)模生產(chǎn)及在茶飲料行業(yè)的應(yīng)用提供物質(zhì)材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

黑曲霉(Aspergillusniger)CICIM F0510[14]和大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109由本實驗室保藏。表達(dá)宿主PichiapastorisGS115以及表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K購于Invitrogen公司。重組質(zhì)粒pPIC-tahA、重組畢赤酵母工程菌GS115 (pPIC-tahA)由本研究中構(gòu)建、篩選并保藏。霉菌和大腸桿菌分別采用PDA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；酵母培養(yǎng)基YPD、MD、G418-YPD、BMGY和BMMY等配制方法參考Invitrogen公司的Pichia Expression Kit。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶(AvrⅡ、SnaB I、XbaI、NcoI、SacI)、LATaqDNA Polymerase以及T4DNA連接酶等購自寶生物工程(大連)有限公司；RNA抽提試劑盒(High Pure RNA Isolation Kit)和cDNA合成試劑盒(Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit)為Roche公司產(chǎn)品；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒小量提取試劑盒、小量DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒和1st Strand cDNA Synthesis Kit由Thermo Scientific公司提供；無氨基酵母氮源、胰蛋白胨和酵母抽提物購于英國OXOID公司；底物沒食子酸甲酯購自國藥化學(xué)試劑有限公司；遺傳霉素(G418)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechingallate, GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechingallate, ECG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC)、沒食子兒茶素(gallocatechin, GC)、表兒茶素(epicatechin, EC)和沒食子酸(gallic acid, GA)等均由北京索萊寶科技有限公司提供；羅丹寧為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母工程菌的構(gòu)建

1.2.2 重組單寧酶的分泌表達(dá)和初步純化

將畢赤酵母重組菌GS115(pPIC-tahA)在YPD平板上進(jìn)行純化，挑選單菌落接種到25 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600=2.0～6.0，約18～20 h)。按1%(V/V)接種量接入50 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期。然后離心(4 ℃、6 000 r/min)5 min收集菌體，將酵母細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積的BMMY培養(yǎng)基中，使其OD600值為1.0，并于30 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24 h補加無水甲醇至終濃度為0.5%(V/V)以維持誘導(dǎo)，并同時取樣測定酶活，直至酶活不再升高。

發(fā)酵結(jié)束后，離心(4 ℃、8 000 r/min、10 min)收集粗酶液。采用鹽析、脫鹽(PD-10脫鹽柱)和Sephadex G-75凝膠層析法對重組酶進(jìn)行純化，并通過酶活測定和SDS-PAGE分析蛋白的純化情況。其中，SDS-PAGE參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行，采用5%的濃縮膠和12%的分離膠。

1.3 重組單寧酶的酶學(xué)特征分析

1.3.1 酶活測定方法

采用分光光度法[17]測定單寧酶的酶活。其一般步驟如下：將250 μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液與250 μL 0.01 mol/L沒食子酸甲酯溶液混勻后，在pH值4.5和30 ℃反應(yīng)20 min。煮沸5 min后，冷卻至30 ℃，并加入6.67 g/L羅丹寧(溶于無水甲醇中)溶液?；靹蚝?，于30 ℃溫浴5 min。再加入200 μL溫浴的0.5 mol/L KOH溶液，于30 ℃孵育5 min。加入4 mL去離子水，混勻，于30 ℃繼續(xù)溫浴10 min。最后，在520 nm下測定吸光度，并計算相對酶活。

酶活定義：在反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)水解沒食子酸甲酯產(chǎn)生1 μmol沒食子酸所需的酶量為1個酶活力單位，以U/mL表示。

蛋白質(zhì)含量的測定參照BRADFORD法[18]，以牛血清白蛋白V部分為標(biāo)準(zhǔn)參照品。

1.3.2 重組酶的最適作用溫度和熱穩(wěn)定性分析

在不同溫度(20～60 ℃)和pH值4.5條件下測定重組酶TahA的酶活，以酶活最高者為100%，計算相對酶活，從而確定該酶的最適作用溫度。

將重組酶在不同溫度(20～70 ℃)下孵育1 h，每隔15 min取樣，按照1.3.1的方法測定剩余的單寧酶酶活。以未進(jìn)行熱處理的酶液的酶活力為100%，計算相對酶活，確定單寧酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.3 重組酶的最適作用pH值和pH穩(wěn)定性分析

在不同反應(yīng)pH值下(pH 3.0～8.0)，以溶于相應(yīng)pH值緩沖液的沒食子酸甲酯為底物進(jìn)行反應(yīng)，然后按照1.3.1的方法測定酶活。以酶活最高者為100%，計算相對酶活，從而確定單寧酶的最適作用pH值。所用緩沖液為50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸鈉緩沖液。

將重組酶在不同pH值(pH 3.0～8.0)的緩沖液中孵育2 h，每隔30 min取樣，并以溶于相應(yīng)pH值緩沖液的沒食子酸甲酯為底物，按照1.3.1的方法測定酶活。以酶活最高者為100%，計算殘余酶活，從而確定單寧酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.4 金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對重組單寧酶酶活的影響

在單寧酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)的體系中，加入不同的金屬離子或化合物，使其終濃度為2 mmol/L，然后按照1.3.1的方法進(jìn)行酶活測定。以不加金屬離子的反應(yīng)體系的酶活為100%，計算不同金屬離子或化合物下的相對酶活。

1.3.5 重組單寧酶動力學(xué)參數(shù)的測定

以不同濃度(0.1～10.0 mmol/L)的沒食子酸甲酯為底物，在重組單寧酶的最適反應(yīng)pH值和溫度下測定其酶活。以米氏方程作為模型，采用雙倒數(shù)法作圖，即可得到單寧酶的動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax。

1.4 重組單寧酶對酯型兒茶素的水解產(chǎn)物分析

取500 μL適當(dāng)稀釋的酶液，分別與500 μL 1 mg/mL EGCG、ECG和GCG溶液混勻，在單寧酶的最適作用溫度和pH值下反應(yīng)20 min后，沸水浴10 min滅酶。用0.22 μm膜過濾反應(yīng)液后，采用液相色譜檢測過濾液中的產(chǎn)物組成[19]。液相分析條件如下：色譜柱：C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；檢測器：RID紫外吸收檢測器；柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；流動相：A液(乙腈∶乙酸∶水=9∶2∶89)，B液(乙腈∶乙酸∶水=80∶2∶18)；梯度洗脫條件：100%A(0 min)-100%A(10 min)-68%A和32%B(25 min)-68%A和32%B(35 min)-100%A(45 min)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉單寧酶的克隆表達(dá)和分離純化

提取黑曲霉CICICM F0510的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此cDNA為模板，采用引物TahA1和TahA2對單寧酶基因tahA進(jìn)行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI酶切后，克隆入pPIC9K的SnaB I和AvrII位點。將重組質(zhì)粒用NcoI進(jìn)行酶切驗證，獲得了重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC-tahA。進(jìn)一步經(jīng)DNA測序，確認(rèn)了所克隆的tahA基因具有完整的開放閱讀框，且其序列與A.nigerCBS 513.88基因組公布的序列(Gene ID：4990346)完全一致。其大小為1 689 bp，編碼562個氨基酸殘基。將重組質(zhì)粒pPIC-tahA用SacI線性化后，通過電轉(zhuǎn)化將目的基因整合到畢赤酵母GS115染色體DNA上，獲得重組畢赤酵母GS115 (pPIC-tahA)。在250 mL三角瓶培養(yǎng)條件下，發(fā)酵進(jìn)行到120 h時，重組菌的產(chǎn)酶水平達(dá)到最高，為1.04 U/mL。

進(jìn)一步通過鹽析、脫鹽和凝膠過濾層析法將重組酶TahA進(jìn)行純化，其得率、純化倍數(shù)和比酶活分別為21.4%、13.9倍和11.5 U/mg。蛋白電泳的結(jié)果表明：與目前已報道的大多數(shù)單寧酶一樣[2, 4, 20]，粗酶液和純化后的TahA均含有2個亞基(圖1)，它們的大小分別為48和42 ku。而未經(jīng)β-巰基乙醇和熱處理的天然TahA的分子量為90 ku左右，遠(yuǎn)高于其理論分子量(61.4 ku)，這可能是因為該酶已經(jīng)被糖基化修飾了[21]。

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-純化后未經(jīng)β-巰基乙醇和熱處理的TahA；2-變性后的TahA粗酶液；3-純化后變性的TahA圖1 SDS-PAGE分析TahA的純化情況Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purification of TahA

2.2 重組單寧酶的酶學(xué)特性解析

2.2.1 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

分別在不同溫度(10、20、25、30、35、40、45、50、55和60 ℃)和pH值4.5條件下測定TahA的酶活，結(jié)果如圖2-a所示。重組單寧酶的最適作用溫度為30 ℃，當(dāng)溫度低于或高于30 ℃時，酶促反應(yīng)速率會逐漸下降。反應(yīng)溫度在30～35 ℃之間時，重組單寧酶有較高的活性(相對酶活>80%)；而當(dāng)溫度高于55 ℃時，其相對酶活小于40%。

將酶液分別在不同溫度(20、30、40、50、60和70 ℃)下孵育15、30、45和60 min后，取樣測定TahA的殘余酶活，結(jié)果匯總于圖2-b。重組單寧酶在20～50 ℃保溫1 h后，其相對酶活力仍保持60%以上，其中重組酶在20和30 ℃孵育1 h后的相對酶活保持在80%以上；在60 ℃保溫15 min和1 h后，其相對酶活分別保持在70%和20%以上；而當(dāng)該酶在70 ℃下保溫15 min時，其相對酶活急劇下降至40%左右；孵育1 h后，單寧酶則幾乎完全失活。

圖2 溫度對TahA的酶活(a)和穩(wěn)定性(b)的影響Fig.2 Effects of temperature on the activity (a) andstability (b) of TahA

2.2.2 最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性

在30 ℃條件下，分別在不同pH值條件(pH值3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0)下測定重組單寧酶TahA的酶活，結(jié)果如圖3-a所示。單寧酶TahA的最適作用pH值為4.0～4.5。在該范圍內(nèi)，TahA的相對酶活維持在100%左右。而當(dāng)pH值小于3.0或大于6.0時，其相對酶活均小于40%。

將單寧酶TahA在不同pH值(pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0和7.0)緩沖液中孵育0.5、1.0、1.5和2.0 h后，取樣測定其殘余酶活，結(jié)果如圖3-b所示。除了在pH值3.5和5.0孵育2 h后的殘留酶活在70%和60%左右，該酶在pH 3.5～5.0的緩沖液中殘留酶活均維持在80%以上；分別在pH值3.0和6.0的緩沖液中保溫2 h后，該酶仍能保持50%和30%以上的相對酶活；而當(dāng)緩沖液的pH值為7.0時，TahA的相對酶活迅速下降，1 h后殘余酶活力不足10%。

圖3 pH對TahA的酶活(a)和穩(wěn)定性(b)的影響Fig.3 Effects of pH on the activity (a) and stability (b)of TahA

2.2.3 金屬離子和化學(xué)試劑對TahA酶活的影響

在單寧酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)的體系中，加入不同的金屬離子或化合物，使其終濃度為2 mmol/L，研究它們對單寧酶酶活的影響，結(jié)果如圖4所示。Cu2+、Mn2+和K+對重組酶的活性有明顯的促進(jìn)作用。Co2+、Fe3+、Mg2+、Zn2+和EDTA對TahA的活性有輕微的抑制作用；Ca2+和Sn2+對重組酶的活性有強烈的抑制作用；而SDS則幾乎完全抑制重組酶單寧酶的活性。

圖4 金屬離子和化學(xué)螯合劑對TahA酶活的影響Fig.4 Effects of metal ions and chemicals on the activityof TahA

2.2.4 動力學(xué)參數(shù)的測定

以不同濃度(0.1～10.0 mmol/L)的沒食子酸甲酯為底物，在重組單寧酶的最適反應(yīng)pH和溫度下測定其酶活。然后采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，以酶促反應(yīng)初速率倒數(shù)1/[V]對底物濃度倒數(shù)1/[S]作圖。由測定結(jié)果可知，單寧酶對沒食子酸甲酯的水解作用符合米氏方程，其線性回歸方程為y=11.807x+2.295 6(R2=0.997 3)。此外，TahA的Vmax和Km值分別為0.436 μmol/(mL·min)和5.143 mmol/L。

2.3 重組單寧酶對酯型兒茶素的水解作用

為了進(jìn)一步確定重組單寧酶對酯型兒茶素的水解作用，分別以1 mg/mL EGCG、ECG和GCG為底物，在單寧酶的最適作用溫度和pH條件下進(jìn)行水解，并通過HPLC分析酶解產(chǎn)物。從液相圖譜(圖5)可以看出，單寧酶可以水解酯型兒茶素的酯鍵，分別將EGCG、ECG和GCG水解為非酯型兒茶素(EGC、EC和GC)和沒食子酸。且在此條件下，單寧酶TahA水解EGCG、ECG和GCG產(chǎn)生的沒食子酸的濃度分別為33.98 μg/mL、87.00 μg/mL和22.58 μg/mL。可見，重組單寧酶TahA對3種底物的水解能力為ECG>EGCG>GCG，水解能力的不同可能跟底物的結(jié)構(gòu)特異性有關(guān)。

a、b和c分別為EGCG、ECG和GCG的水解產(chǎn)物分析圖5 重組單寧酶TahA水解酯型兒茶素的產(chǎn)物分析Fig.5 HPLC profiles of ester catechins hydrolyzed byrecombinant tannase TahA

3 討論

在茶飲料的生產(chǎn)和冷藏過程中，茶葉提取液冷卻到4 ℃以下時會變渾濁(“冷后渾”現(xiàn)象)，并產(chǎn)生絮狀沉淀，影響了茶飲料的品質(zhì)[5]，這一直是茶飲料行業(yè)需要解決的關(guān)鍵問題。單寧酶專一性水解沒食子酸單寧中酯鍵和縮酚酸鍵的特點，使其成為茶飲料生產(chǎn)中使用的主要酶制劑[22]。在茶飲料中應(yīng)用單寧酶，可轉(zhuǎn)溶茶沉淀，增加茶湯澄清度，對茶飲料的品質(zhì)改良產(chǎn)生積極作用[5]。但單寧酶在茶飲料行業(yè)的應(yīng)用缺乏酶學(xué)性質(zhì)研究和受到生產(chǎn)成本較高等因素的限制。

該研究通過DNA重組技術(shù)將黑曲霉CICIM F0510單寧酶基因tahA在畢赤酵母GS115中進(jìn)行了克隆表達(dá)。在搖瓶中發(fā)酵120 h后，重組菌的產(chǎn)酶水平達(dá)到1.04 U/mL，高于Bacilluslicheniformis、Serratiaficaria和黑曲霉GH1等來源的單寧酶的酶活(分別為0.356、0.56和0.344 U/mL)[8, 23-24]，但卻低于單寧酶Tan7和A.nigerN5-5的酶活(分別為111.5和471.35 U/mL)[1, 11]。后續(xù)將通過發(fā)酵條件優(yōu)化，進(jìn)一步提高重組酶TahA的表達(dá)量。此外，重組畢赤酵母GS115 (pPIC-tahA)發(fā)酵液中的雜蛋白較少(圖1)，有利于單寧酶的分離純化。

酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，與大多數(shù)單寧酶的最適反應(yīng)溫度(30～60 ℃)和溫度穩(wěn)定范圍(≦60 ℃)[3]相似，重組酶TahA的最適作用溫度為30 ℃，且在20～50 ℃范圍內(nèi)都具有較好的穩(wěn)定性(圖2)。重組單寧酶的最適作用pH值為4.5，在pH 3.0～6.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好(圖3)，也與真菌單寧酶的最適pH值(4.0～6.0)和pH耐受性范圍(3.0～7.0)相符[3, 5]。而茶葉浸提物的pH值通常在5.0～6.0之間，其中紅茶和綠茶茶湯的pH值分別為5.0和5.7。單寧酶TahA的最適pH值和pH穩(wěn)定范圍偏酸性的特點為其在茶飲料生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了可能。然而，由于重組單寧酶TahA經(jīng)過了糖基化修飾，其酶學(xué)性質(zhì)可能會跟野生型單寧酶存在一些差異。后續(xù)將利用內(nèi)切糖苷酶等將其去糖基化后，再確認(rèn)其酶學(xué)性質(zhì)。

茶葉提取液的“冷后渾”問題主要是由多酚類物質(zhì)與咖啡堿等相互作用，形成不溶性的絡(luò)合沉淀造成的，而多酚類物質(zhì)中兒茶素的含量約為80%[25]。重組單寧酶TahA可以水解具有苦澀味的酯型兒茶素(EGCG、ECG和GCG)，生成非酯型兒茶素(EGC、EC和GC)和沒食子酸(圖5)。后者可以與茶紅素、茶黃素等競爭茶飲料中的咖啡堿，形成分子量較小的水溶物，從而提高茶飲料的澄清度和穩(wěn)定性，并降低其苦味[5, 26]。此外，EGCG是兒茶素的主要成分，約占綠茶中總多酚含量的40%，而且EGC的抗氧化活性大于EGCG[27]。因此，將EGCG水解為EGC還有利于提高茶飲料的抗氧化性[28]。

綜上所述，本研究通過分子克隆與遺傳重組技術(shù)成功將黑曲霉單寧酶基因tahA在畢赤酵母中進(jìn)行了分泌表達(dá)與酶學(xué)特性研究。重組酶單寧酶良好的理化性質(zhì)以及對酯型兒茶素的水解作用，為其在茶飲料生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。