心痛寧加味方對(duì)蒽環(huán)類藥物表柔比星誘導(dǎo)小鼠急性心肌損害的保護(hù)作用

王巧琳，段春燕，陸 明，胡 蘭，林 燕

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830000）

表柔比星是臨床上常用的蒽環(huán)類化療藥物之一，其主要用于血液腫瘤與實(shí)體腫瘤的化療治療中，但在臨床應(yīng)用過程中，表柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性作用限制其應(yīng)用劑量，進(jìn)而影響表柔比星的效果與安全性[1]。相關(guān)調(diào)查研究顯示，心痛寧加味方在臨床中具有良好的心肌保護(hù)作用，其還可對(duì)蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)心臟功能的損害具有一定保護(hù)與遏制作用，但對(duì)其實(shí)際應(yīng)用的安全性以及應(yīng)用劑量仍存在一定的爭(zhēng)議[2-3]。本研究探討心痛寧加味方對(duì)表柔比星誘導(dǎo)小鼠急性心肌損害的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取雌性健康SD小鼠60只，平均體質(zhì)量為（280±25）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證編號(hào)為SCXK（2014-0004），選取后飼養(yǎng)于25℃、45%濕度的環(huán)境中備用。采用隨機(jī)數(shù)字表法將所有小鼠分為6組，分別為對(duì)照組、表柔比星模型組、表柔比星聯(lián)合心痛寧加味方高劑量組、中劑量組、低劑量組、丹參組（表柔比星+丹參），10只/組。

1.2 研究方法 對(duì)照組小鼠選擇雙側(cè)腹腔分別注射生理鹽水，5 mL/kg，間隔30 min注射，每隔1日注射1次，7日內(nèi)共注射4次；模型組則為腹腔內(nèi)注射表柔比星與生理鹽水，表柔比星4.5 mg/kg，每隔1日注射1次，7日內(nèi)共注射4次，注射表柔比星前30 min選擇另一區(qū)域向腹腔內(nèi)注射生理鹽水，5 mL/kg；丹參組向腹腔內(nèi)注射表柔比星與丹參片制備的溶液，表柔比星劑量為5 mL/kg，丹參片劑量為10 mg/kg；其他3組均為注射表柔比星與心痛寧加味方溶液，其中表柔比星劑量為4.5 mg/kg，低劑量組于表柔比星注射前30 min在另一區(qū)域內(nèi)腹腔注射心痛寧加味方溶液，45 mg/kg，中劑量組則為67.5 mg/kg，高劑量組則為90 mg/kg。

1.3 觀察指標(biāo) 末次給藥后24 h采血并處死大鼠，采集標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)，BNP、h-FABP 、NO 、SOD活性、cTnI檢測(cè)試劑盒由奶精建成生物工程研究所提供，Tunel試劑盒由博士德提供，采用速率法測(cè)量血漿BNP含量，采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法定量分析cTnI水平，WST-1法測(cè)量SOD活性，TBA法測(cè)定h-FABP 、NO含量。取小鼠左室心肌應(yīng)用多聚甲醛固定后進(jìn)行HE染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織損傷的形態(tài)學(xué)變化，并以病例評(píng)分法對(duì)心肌病變程度進(jìn)行半定量分析。Tunel法檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，選擇左室心肌應(yīng)用多聚甲醛進(jìn)行固定并應(yīng)用Tunel進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算凋亡指數(shù)為凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行不同分組表達(dá)量分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s ）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中BNP、cTnI、h-FABP、SOD及NO含量比較 見表1。

2.2 各組小鼠心肌損害病理表現(xiàn)分析 通過對(duì)HE染色病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠心肌切片鏡下心肌細(xì)胞形態(tài)基本正常，部分心肌細(xì)胞間隙增寬，可見少量細(xì)胞空泡變性及間質(zhì)少量纖維組織增生；模型組鏡下見部分心肌細(xì)胞空泡變性，部分細(xì)胞間隙增寬，部分細(xì)胞溶解、壞死，并見纖維組織增生；高劑量組鏡下見部分心肌細(xì)胞空泡變性及間隙增寬，部分間質(zhì)內(nèi)脂肪、纖維組織增生；中劑量組鏡下見部分心肌細(xì)胞空泡變性及間隙增寬，少部分心肌細(xì)胞溶解、壞死，部分間質(zhì)可見少量纖維組織增生及少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；低劑量組鏡下見部分心肌細(xì)胞間隙增寬，少量心肌細(xì)胞空泡變性，部分間質(zhì)少量纖維組織增生。

表1 各組大鼠血清中BNP、cTnI、h-FABP、SOD及NO含量比較（± s ，n = 10）

表1 各組大鼠血清中BNP、cTnI、h-FABP、SOD及NO含量比較（± s ，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05，△P＜0.01

組 別 BNP/（pg/mL） cTn-I/（pg/mL） hFABP/（ng/mL） SOD/（U/mL） NO/（μmol/L）對(duì)照組 258.708±72.388 484.781±62.726 1.379±0.088 193.222±25.080 0.432±0.066模型組 543.046±80.607△ 727.432±26.747△ 1.786±0.010# 88.147±8.280# 0.802±0.156#表柔比星+丹參組 313.831±8.911# 550.681±11.619△ 1.406±0.077# 141.035±4.621# 0.602±0.076#表柔比星+高劑量組 289.352±38.281# 579.497±13.274△ 1.432±0.017# 117.529±12.960# 0.551±0.044#表柔比星+中劑量組 372.755±41.583△ 653.275±48.158△ 1.726±0.150# 111.736±26.719# 0.649±0.080#表柔比星+低劑量組 375.469±22.706△ 699.871±12.313△ 1.747±0.143# 90.818±16.053# 0.702±0.043#

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞病理評(píng)分及凋亡指數(shù)情況比較 見表2。

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞病理評(píng)分及凋亡指數(shù)情況比較（± s ，n = 10）

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞病理評(píng)分及凋亡指數(shù)情況比較（± s ，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.001，△P＜0.01

組 別 病理評(píng)分/分 凋亡指數(shù)/%對(duì)照組 0 1.52±0.74模型組 2.71±0.25# 66.54±3.82##表柔比星+低劑量組 1.91±0.19# 35.33±1.85△表柔比星+中劑量組 1.70±0.24# 20.59±2.35△表柔比星+高劑量組 1.19±0.21# 16.47±1.62#表柔比星+丹參組 1.20±0.18# 16.52±1.25#

2.4 心痛寧加味方激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中蛋白的表達(dá) 見圖1，圖2，圖3。

圖1 PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中mTOR及其磷酸化和AKT及其磷酸化蛋白表達(dá)變化

圖2 AKT與mTOR蛋白相對(duì)于actin的表達(dá)量分析

A.對(duì)照組；B.模型組；C.表柔比星+低劑量組；D.表柔比星+中劑量組；E.表柔比星+高劑量組；F.表柔比星+丹參組

圖3 p-AKT、p-mTOR分別相對(duì)于AKT、mTOR的表達(dá)量分析

2.5 心痛寧加味方激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路中mRNA的表達(dá) 見圖4。

圖4 心痛寧加味方激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路中mRNA的表達(dá)

3 討論

表柔比星等蒽環(huán)類藥物誘發(fā)的心肌損害是其常見的藥物不良反應(yīng)，其心肌損傷機(jī)制可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)，其中氧自由基所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡是心功能損害的主要機(jī)制，試驗(yàn)研究[4-5]顯示即使心肌細(xì)胞暴露于極低濃度的表柔比星中，同樣可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的加劇。目前心肌組織活檢是評(píng)估蒽環(huán)類藥物心臟損害的金標(biāo)準(zhǔn)[6]，而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過表柔比星的心肌損害，可見其心腔的明顯增大以及心室壁變薄，并有一定的風(fēng)險(xiǎn)誘發(fā)心包積液、擴(kuò)張型心肌病等，隨著病情的加重可出現(xiàn)細(xì)胞間隙明顯增寬、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象[7-8]。

本研究結(jié)果表明，各組BNP、h-FABP 、NO、SOD活性、cTnI指標(biāo)比較存在顯著差異，模型組心肌細(xì)胞病例評(píng)分明顯高于低、中、高劑量組，并且各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較存在顯著差異，以模型組心肌損害、凋亡效果最為嚴(yán)重，除對(duì)照組外以高劑量組心肌損害、凋亡最輕。心痛寧加味方是沈?qū)毞淌诟鶕?jù)“痰瘀同治”的治療原則，在心痛寧方基礎(chǔ)上配伍新疆民族藥中化痰通絡(luò)之品組方。沈?qū)毞淌谡J(rèn)為，腫瘤病雖為本虛標(biāo)實(shí)之證，但痰濕凝聚是導(dǎo)致其發(fā)生的重要方面，在腫瘤的形成過程中，痰濕乃因血瘀導(dǎo)致津液運(yùn)行失常而成，一旦形成則痰瘀互結(jié)，日久成積，從而形成了血瘀津停，痰瘀互結(jié)的腫瘤病機(jī)的基礎(chǔ)[9-10]。方中瓜蔞、薤白利氣化痰，散結(jié)寬胸，溫陽止痛；佐以當(dāng)歸、丹參、紅花、川芎活血化瘀，行氣止痛；配合以厚樸、桔梗苦降辛開，行氣散結(jié)[11]；伍以新疆民族藥新塔花、阿里紅、沙棘、豆蔻，氣血雙調(diào)。諸藥配合，瘀祛痰消，脈絡(luò)通暢，疼痛得解。通過進(jìn)一步回顧分析認(rèn)為，丹參作為唇形科多年生草本植物在藥典中具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等功效，成分中主要有脂溶性的多種丹參酮類及水溶性的原兒茶酚醛和兒茶酚的衍生物[12-14]，具有擴(kuò)張冠脈、增加血流量、耐缺氧、增強(qiáng)心肌收縮力、減慢心率的功效，從而促進(jìn)組織修復(fù)，改善心臟功能，應(yīng)用于小鼠中同樣可遏制蒽環(huán)類藥物心臟損害進(jìn)程，為小鼠心肌提供保護(hù)作用[15]。

綜上所述，心痛寧加味方對(duì)表柔比星誘導(dǎo)的小鼠心肌損害具有良好的保護(hù)作用，可有效降低氧自由基的產(chǎn)生，并通過降低脂質(zhì)過氧化物含量達(dá)到改善心肌損害及調(diào)節(jié)凋亡的目的。但本研究仍存在一定的缺點(diǎn)與不足，如樣本容量過小可能導(dǎo)致結(jié)果客觀性不足，這有待于進(jìn)一步臨床研究證實(shí)。