自然淹水后疏花水柏枝多酚類物質含量及抗氧化能力變化分析

劉宇爍　孔玉珊　田偉　蔡利鵬　謝小兵

摘 要 疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）特異分布于三峽消漲帶地區(qū)，對澇害具有較強的適應性，能耐受因低氧導致的氧化脅迫。本研究應用福林酚試劑法分析了自然淹水前后疏花水柏枝不同組織部位多酚類物質的含量，并用體外活性檢測和體內(nèi)評價相結合的方法，比較了淹水脅迫前后的抗氧化能力差異。結果表明疏花水柏枝多酚含量豐富，而且其提取物具有較強的抗氧化能力，對大腸桿菌的氧化損傷具有明顯的保護作用；淹水后多酚含量、總抗氧化能力、體內(nèi)抗氧化活性均顯著低于淹水前的各組織，特別以葉片部位下降幅度最大。分析表明，自然淹水脅迫前后疏花水柏枝的多酚含量、體外抗氧化活性、體內(nèi)抗氧化保護三者之間存在一定的相關性，表明多酚類物質作為疏花水柏枝抗氧化活性的主要物質之一，參與了其對淹水脅迫的生態(tài)適應。

關鍵詞 疏花水柏枝 淹水脅迫 多酚 抗氧化

澇害是一種阻礙植物生長發(fā)育的重要脅迫因子，嚴重影響著全球的農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，世界上約12%的耕地受澇害影響，在我國僅黃淮平原和長江中下游地區(qū)，每年平均有7.3？07 hm2受到澇災。近年來隨著全球氣候變化，澇害發(fā)生的頻率、持續(xù)時間和受災面積呈逐年上升趨勢。

探索植物對淹水脅迫的適應機理，促進農(nóng)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展，一直是植物學研究領域的一大熱點。人們對分布在澇漬地區(qū)的物種開展研究，分析其生態(tài)適應性，探索其抗水分脅迫能力的機制，并將之推廣應用，是提高植物抗?jié)澈γ{迫能力的一種有效方法。疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）特異分布于三峽消漲帶地區(qū)，系一種檉柳科（Tamaricaceae）水柏枝屬（Myricaria）灌木。由于常遭受季節(jié)性的洪水淹沒，該物種對低氧環(huán)境顯示出較強的耐受性，進化出較強的抗氧化能力。十年前有學者預測它將因三峽大壩的建成而滅絕，可是近年來人們發(fā)現(xiàn)，在大壩下游河灘或江心小島也有少量疏花水柏枝分布，說明該物種在漫長的生態(tài)適應過程中，進化出較強的抗氧化損傷和水淹脅迫能力。

近年來研究表明，淹水導致的氧化脅迫和活性氧自由基積累是導致其生長發(fā)育受阻的重要原因。一些抗逆性較強的植物，可以通過抗氧化保護酶類和抗氧化小分子物質來調(diào)節(jié)活性氧的平衡狀態(tài)。而植物體的多酚類化合物（polyphenols）因其出色的抗氧化活性引起了人們的廣泛關注，它是一類有多個酚羥基的次生代謝產(chǎn)物，結構多樣，分布廣泛。隨著物質分離鑒定技術的發(fā)展，人們已分離鑒定出了千余種多酚類化合物，主要包括酚酸類、二苯乙烯、黃烷酮類及木質素等化合物。

為了進一步明確多酚類物質在疏花水柏枝水淹脅迫和抗氧化代謝中起的作用，本研究以自然淹水脅迫前后的疏花水柏枝的不同組織為研究對象，分析了其多酚類物質的含量，評價了其抗氧化能力在淹水條件下的變化規(guī)律，為明確多酚類物質在植物澇害脅迫中的作用奠定基礎。

1材料與方法

1.1植物組織材料及處理

新鮮的疏花水柏枝樣品取自三峽河岸帶宜昌胭脂壩地區(qū)，東經(jīng)109？2'-110？2'，北緯30？53'N - 31 ？'N。取淹水前（7月）后（10月）的疏花水柏枝（如圖1）根、莖、葉干燥并粉碎，準確稱量50 g后放入圓底燒瓶中，分別加入80%乙醇溶液200mL，回流提取3次，2h/次，合并三次提取液，過濾，減壓低溫濃縮，再用80%乙醇溶解，過濾并定容至200mL，使用時稀釋20倍。分別測定其多酚含量和抗氧化值，每組5個重復。

1.2多酚含量測定

由于多酚類化合物分子上有極易氧化的羥基，而Folin-Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸可以在堿性條件下將其氧化成藍色化合物，該物質在765 nm處有最大的光吸收，從而可用于精確測量。Folin-Ciocalteu試劑：于500 mL的圓底燒瓶中加入鉬酸鈉12.5 g、鎢酸鈉50 g、倒入蒸餾水350 mL、濃鹽酸50 mL、85%的濃磷酸25 mL，冷凝回流處理10個小時，移去冷凝管，待溶液稍冷卻以后添加75 g的硫酸鋰和滴入數(shù)滴溴水，使燒瓶開口繼續(xù)維持沸騰的狀態(tài)15 min，用以除去多余的溴。結束回流，待溶液冷卻以后，定容到500 mL，濾紙過濾，轉入棕色試劑瓶中，4 ℃冰箱中冷藏備用，使用時需稀釋一倍。

以沒食子酸為標準溶液制作多酚測定的標準曲線。先用80%乙醇溶解10 mg的沒食子酸并定容至100 mL，然后將不同濃度梯度的沒食子酸溶液置入比色管中，加入1.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，8 min后加入4.5 mL 10% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至25 mL，在25℃下水浴2 h，蒸餾水作為空白對照，在765 nm波長下測定吸光值。各樣品多酚的測定方法同上，對照標準曲線，計算多酚含量。

1.3總抗氧化能力（T-AOC）測定

采用總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒（南京建成公司）對各粗提物進行測定，利用抗氧化物質能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質形成穩(wěn)固的絡合物，通過520nm 測定的吸光度可測出其抗氧化能力的高低，具體操作按照產(chǎn)品說明書進行。在37℃時，每分鐘每毫升使反應體系的吸光度（OD）值每增加0.01 時，定義為一個總抗氧化能力單位，樣品總抗氧化能力計算公式如下：

式中，ODu為測定管OD值；

ODc為對照管OD值；

N為樣品稀釋的倍數(shù)（反應液總量/取樣量）；

n為樣本測試前稀釋的倍數(shù)。

1.4提取物對對大腸桿菌抗氧化保護作用

采用本實驗室建立的過氧化氫氧化損傷模型來分析提取物對大腸桿菌抗氧化保護作用。將250mL搖瓶中處于對數(shù)生長期的大腸桿菌菌液中分別加入3mL濃度為mg/mL的粗提物，培養(yǎng)24h后，加入終濃度為0.2mM的H2O2溶液，再培養(yǎng)12h，然后取1mL大腸桿菌菌液稀釋到106，取0.5mL涂布于培養(yǎng)皿中，12h后計數(shù)并計算存活率。用1mg/mL的維生素C做正對照，每組數(shù)據(jù)重復5次。

1.5統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以x眘表示，5個重復，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。

2結果與分析

2.1疏花水柏枝多酚類物質在淹水前后的變化

首先根據(jù)沒食子酸的濃度梯度繪制多酚測定的標準曲線，縱坐標為765 nm下的吸光值，橫坐標為標準溶液的濃度。標準曲線如圖2所示，其線性關系為：Y = 0. 0214x + 0. 013，線性相關系數(shù)為0. 9992，表明沒食子酸濃度在0～50%eg/mL范圍內(nèi)與其吸光值呈良好的線性關系（如圖2）。

根據(jù)獲得的標準曲線測定了疏花水柏枝在淹水前后不同部位多酚類物質，結果顯示在疏花水柏枝的不同部位均有較豐富的多酚類物質，而且淹水脅迫導致其根、莖、葉部位的多酚含量顯著下降，尤以葉片下降的幅度最大，降幅達到80%（表1），根和莖次之，降幅分別達到33.6%和25.9%，表明多酚類物質參與了疏花水柏枝的淹水脅迫代謝。

2.2疏花水柏枝淹水前后體外抗氧化能力分析

為了測定淹水脅迫對疏花水柏枝抗氧化能力的影響，實驗采用總抗氧化試劑盒測定了淹水前后不同組織部位的體外抗氧化能力，結果表明根、莖、葉的抗氧化值在淹水后均發(fā)生了顯著下降。但是不同組織部位下降的幅度不一樣，與多酚類物質的含量類似，尤以葉片部位的抗氧化值下降得最為明顯，只有淹水前的17%（如圖3）。

均采用淹水前后的數(shù)據(jù)對比進行顯著性分析，* P<0.05，**P<0.01， n=5

2.3體內(nèi)抗氧化能力分析對大腸桿菌的抗氧化保護作用

由于不同抗氧化能力測定方法可能有一定的差異，為了進一步明確疏花水柏枝不同部位的抗氧化能力，我們利用大腸桿菌為實驗材料，用0.2mM的H2O2溶液模擬氧化損傷，進行了體內(nèi)抗氧化保護實驗。結果表明在淹水脅迫前，疏花水柏枝淹水前的各組織部位均有較好的抗氧化保護效果，能有效保護過氧化氫導致的氧化損傷，其中根部的效果最好，與正對照Vc的保護效果相當（如圖4）。值得一提的是，大多數(shù)樣品均可促進大腸桿菌的正常生長，其生長狀態(tài)明顯優(yōu)于空白組（不加H2O2），反映疏花水柏枝的提取物可以促進細菌的增殖。淹水后各部位對大腸桿菌的抗氧化保護作用均出現(xiàn)了下降，與多酚類物質的下降趨勢類似，尤其以葉部下降的幅度最大，達到94%（如圖4）。

前根：淹水前的根部；后根：鹽水后的根部。采用Duncan 多重比較分析，P<0.05，n=5

將體內(nèi)和體外的兩種抗氧化測定方法進行了相關分析，結果發(fā)現(xiàn)兩者存在一定的正相關，相關系數(shù)達到0.7923（如圖5），表明兩種測定方法一定程度上可以相互驗證。

2.4多酚類含量與抗氧化值的相關分析

為分析疏花水柏枝的多酚類物質在抗氧化代謝中起到的作用，我們進行了淹水前后多酚類物質含量與體外及體內(nèi)抗氧化活性的相關性。結果表明不管是總抗氧化值還是對大腸桿菌的氧化損傷保護作用，疏花水柏枝的多酚類物質與之都存在一定程度的正相關，其中與總抗氧化值的相關系數(shù)達到0.7679（如圖6），與體內(nèi)的抗氧化活性相關系數(shù)達到0.6336，反應疏花水柏枝的多酚類物質是其起到抗氧化作用的主要物質之一。

3結論與討論

3.1結論

疏花水柏枝的不同組織部位多酚類物質含量豐富，而且其提取物具有較強的抗氧化能力，對大腸桿菌的氧化損傷具有明顯的保護作用。淹水狀態(tài)將影響其多酚含量、總抗氧化能力、體內(nèi)抗氧化活性，淹水后將顯著降低，尤以葉片部位下降幅度最大。自然淹水脅迫前后疏花水柏枝的多酚含量、體外抗氧化活性、體內(nèi)抗氧化保護三者之間存在一定的相關性。

3.2多酚類物質在植物體抗氧化代謝中的作用

疏花水柏枝的抗氧化能力與所含多酚類物質的含量之間具有一定的相關性，暗示多酚類物質可能作為疏花水柏枝抗氧化活性的主要物質之一，幫助植物順利的度過淹水導致的氧化脅迫。本實驗室從疏花水柏枝體內(nèi)分離出一種酚類主物質，3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯，顯示有較強的抗氧化活性，能有效保護神經(jīng)細胞免于氧化損傷，從側面證實了疏花水柏枝的酚類物質在抗氧化代謝中起到了重要作用。

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