不同劑量蔗糖鐵誘導(dǎo)家兔絕經(jīng)后鐵蓄積模型的建立及機制初步探討

鄺立鵬　葉燕彬　江山岳　謝成龍　羅玉

【摘要】 目的：評估不同劑量蔗糖鐵（iron sucrose，IS）通過耳緣靜脈注射誘導(dǎo)家兔絕經(jīng)后鐵蓄積模型建立的可行性及對機制進行初步探討。方法：普通級雌性家兔50只隨機分為5組：假手術(shù)組、去勢組以及模型A、B、C組，各10只。去勢組和模型組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，假手術(shù)組僅切除卵巢周圍部分脂肪組織后即關(guān)閉腹腔。術(shù)后模型A、B、C組分別通過耳緣靜脈注射不同劑量IS（10、15、20 mg/kg），假手術(shù)組和去勢組以同樣方式和頻次給予適量生理鹽水注射。分別于造模前1 d和造模后第8周比較各組血清鐵蛋白（serum ferritin，SF）和17β-雌二醇（estradiol，E2）水平，分析去勢組SF與17β-E2的相關(guān)性。結(jié)果：造模后第8周，模型A、B、C組SF水平均高于假手術(shù)組和去勢組，且模型C組均高于模型A、B組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），去勢組17β-E2水平低于假手術(shù)組（P<0.01），但兩組SF水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；去勢組SF與17β-E2水平無相關(guān)性（r=-0.226，P=0.531）。結(jié)論：耳緣靜脈注射IS可成功誘導(dǎo)家兔絕經(jīng)后鐵蓄積模型的建立，絕經(jīng)后鐵蓄積可能與機體鐵排泄途徑減少及攝入增多有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 蔗糖鐵； 家兔； 絕經(jīng)后； 鐵蓄積； 動物模型

Preliminary Study on Construction of Postmenopausal Ion Accumulation Rabbit Models Induced by Various Doses of Iron Sucrose and Mechanism/KUANG Lipeng，YE Yanbin，JIANG Shanyue，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（27）：0-033

【Abstract】 Objective：To evaluate the feasibility of constructing the postmenopausal ion accumulation rabbit models induced through injection with various doses of iron sucrose（IS） via the ear vein，as well as to preliminarily probe into the mechanism.Method：50 normal grade female rabbits were randomly divided into five groups：sham operation group，castration group and model A，B and C groups，10 rabbits in each group.The castration group and model groups were performed bilateral oophorectomy，while sham group was conducted removal of part of the adipose tissue around the ovary，followed by abdomen closure immediately.The model A，B and C groups were injected with various doses of IS（10，15 and 20 mg/kg） via the ear vein postoperatively respectively，and sham operation group and castration group were administered injection with appropriate amount of saline with the same method and frequency.The levels of serum ferritin（SF） and 17β-estradiol（E2） in each group were compared at 1 d before modeling and eighth weeks after modeling，the correlation between SF and 17β-E2 in castration group was analyzed.Result：Eighth weeks after modeling，the levels of SF in model A，B and C groups were higher than those of sham operation group and castration group，and the model C group was higher than model A and B groups，the differences were statistically significant（P<0.01），the level of 17β-E2 in castration group was lower than that of sham operation group（P<0.01），but the SF level of two groups was compared，the difference was not statistically significant（P>0.05）.There was no correlation between SF and 17β-E2 level in castration group（r=-0.226，P=0.531）.Conclusion：Injection with IS through the ear vein can induce the construction of the postmenopausal ion accumulation rabbit models，and the postmenopausal ion accumulation may be related to the reduced excretion pathways and increased intake of iron of the body.

【Key words】 Iron sucrose； Rabbit； Postmenopausal； Ion Accumulation； Animal models

First-authors address：The Fifth Affiliated（Zhuhai） Hospital of Zunyi Medical College，Zhuhai 519000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.27.008

鐵離子是動物細胞必需的元素之一，參與多種細胞DNA合成、氧轉(zhuǎn)運、細胞呼吸鏈氧化還原反應(yīng)等。正常鐵代謝構(gòu)成機體的鐵穩(wěn)態(tài)，當(dāng)鐵穩(wěn)態(tài)發(fā)生異常時，機體各類系統(tǒng)都會出現(xiàn)相應(yīng)的代謝紊亂，其中鐵過多會催化氧自由基形成，促使細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細胞和組織損害，影響神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)[1]、肝臟系統(tǒng)等器官和組織的功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)，鐵蓄積還與絕經(jīng)后骨代謝異常密切相關(guān)，健康絕經(jīng)后女性骨密度下降與血清鐵蛋白（serum ferritin，SF）水平存在相關(guān)性，鐵蓄積是加速骨量丟失，促進骨質(zhì)疏松發(fā)展的一個獨立危險因素[2]。目前，國內(nèi)外尚缺乏統(tǒng)一的絕經(jīng)后鐵蓄積動物模型，本研究擬通過蔗糖鐵（iron sucrose，IS）家兔耳緣靜脈注射增加鐵的攝入，誘導(dǎo)絕經(jīng)后家兔鐵蓄積模型的建立及對機制進行初步探討?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 雌性5月齡普通級新西蘭兔50只，體重2.3～2.5 ㎏，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[SCXK（粵）2014-0035]。材料與器械由本院動物實驗中心提供：常規(guī)消毒物品、生理鹽水、3%戊巴比妥鈉（麻醉劑）、慶大霉素、無菌紗布及敷料、縫合針及線、手術(shù)刀、持針器、血管鉗、腹腔拉鉤、普通眼科手術(shù)器械、鑷子等；17β-雌二醇（17β-E2）放射免疫試劑盒、SF ELISA試劑盒：武漢貝茵萊生物科技有限公司；美國Thermo-ST16離心機：上海仁器儀器。

1.2 動物分組和模型的建立 （1）動物分組：50只新西蘭兔隨機分為5組：假手術(shù)組、去勢組以及模型A、B、C組，各10只。（2）卵巢切除術(shù)：去勢組和模型A、B、C組以3%戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉，在無菌條件下由恥骨聯(lián)合上正中切口切開腹腔，手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，關(guān)閉腹腔；假手術(shù)組打開腹腔找到卵巢后切除卵巢周圍少許脂肪即關(guān)閉腹腔。術(shù)后均安置在飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度為40%～70%的環(huán)境中。術(shù)后3 d內(nèi)肌注慶大霉素

1萬U/kg，2次/d。術(shù)后定量喂食（50 g/d），自由飲水。（3）注射IS：1周后模型組予耳緣靜脈注射IS，模型A、B、C組劑量分別為10、15、20 mg/kg，每周2次，共8周。假手術(shù)組和去勢組以同樣方式和頻次給予適量生理鹽水注射。

1.3 觀察指標 分別于造模前1 d和造模后第8周行耳緣靜脈采血檢測SF和17β-E2水平，分析去勢組SF與17β-E2的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）；采用線性相關(guān)分析相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 家兔一般情況 各組術(shù)前術(shù)后精神狀態(tài)、活動及反應(yīng)良好，無死亡。模型A、B、C組均未出現(xiàn)動物因注射過量IS而死亡的情況。

2.2 各組SF、17β-E2水平變化 造模前1 d，各組SF、17β-E2水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；造模后第8周，模型A、B、C組SF水平均高于假手術(shù)組和去勢組，且模型C組均高于模型A、B組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；造模后8周，去勢組17β-E2水平低于假手術(shù)組（P<0.01），但兩組SF水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1、2和圖1。

2.3 SF與17β-E2水平的相關(guān)性分析 造模后第

8周，去勢組的SF與17β-E2水平無相關(guān)性（r=-0.226，P=0.531）。

3 討論

臨床上，IS注射液成人的治療劑量為2～3 mg/kg，根據(jù)體表面積折算法[3]，算出家兔的等效劑量為6.17～9.25 mg/kg，為了達到鐵蓄積的目的，本研究三種不同劑量模型組分別采用10、15、20 mg/kg作為誘導(dǎo)劑量。

目前關(guān)于鐵蓄積的研究對象大多為大鼠，但由于大鼠骨皮質(zhì)內(nèi)缺乏哈佛氏系統(tǒng)，無哈佛氏重建，故大鼠不適合作為研究鐵蓄積對皮質(zhì)骨影響的研究動物[3]。此外，大鼠體積小，不易多次采集骨活檢標本及大量血液標本。鑒于鐵蓄積與絕經(jīng)后骨代謝異常，特別是與骨質(zhì)疏松的形成有關(guān)，而骨質(zhì)疏松癥最嚴重的后果是骨折。張林林等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后髖部骨質(zhì)疏松性骨折患者普遍存在鐵蓄積現(xiàn)象。鐵蓄積與骨質(zhì)疏松性骨折關(guān)系的研究中將家兔作為研究對象，可能有以下優(yōu)勢[5]：（1）兔性成熟后骺板閉合與人類相似，具有明顯的哈佛氏重建能力，有利于皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的觀察；（2）兔骨骼轉(zhuǎn)化約為人的3倍，可在短期內(nèi)觀察骨折愈合時骨組織的變化；（3）耳緣靜脈采血和注射藥物方法簡便；

（4）家兔四肢骨屬于長骨，結(jié)構(gòu)與人類相似度較高。綜上，建立家兔絕經(jīng)后鐵蓄積動物模型對研究女性絕經(jīng)后鐵蓄積相關(guān)的疾病，特別是關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的研究具有重大意義。

臨床反應(yīng)鐵穩(wěn)態(tài)的指標主要是SF。SF可結(jié)合

4 500個鐵原子，能較好地反映鐵貯存能力。男性SF含量通常為15～200 μg/L，女性則為12～150 μg/L；

當(dāng)人體SF含量>1 000 μg/L時，被認為是病理性鐵過載，需要臨床降鐵治療；而當(dāng)人體SF含量高于正常值但<1 000 μg/L時，則被認為存在鐵過多（鐵蓄積），目前暫時沒有臨床干預(yù)方案[6]。Wnt/β-catenin信號通路的抑制可造成成骨細胞功能的障礙，從而抑制骨形成[7]。鐵蓄積狀態(tài)下，機體內(nèi)鐵離子可通過芬頓（Fenton）反應(yīng)產(chǎn)生更多活性氧自由基，可催化氧化應(yīng)激反應(yīng)，研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)可以通過抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路，抑制骨形成，促進骨吸收，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[8-9]。近年來研究報道，減少體內(nèi)鐵含量是預(yù)防鐵蓄積導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥的一種方法[10-11]。目前國內(nèi)外尚未有統(tǒng)一標準的絕經(jīng)后鐵蓄積動物模型，因此本研究在參考國內(nèi)外相關(guān)文獻[12-16]的基礎(chǔ)上，設(shè)計了本實驗方案：予去勢后家兔耳緣靜脈注射大劑量IS注射液誘導(dǎo)鐵蓄積。臨床上該藥主要用于正在補充促紅細胞生成素的需長期血液透析的患者的缺鐵性貧血治療，毒性極低，但用藥過量會導(dǎo)致急性鐵過載。通過定期注射IS 8周后檢測SF水平對IS的注射劑量進行考察，結(jié)果顯示耳緣靜脈注射不同劑量IS注射液（10、15、20 mg/kg）后，各組家兔的SF水平均較去勢前升高，其中以模型C組（20 mg/kg）的SF水平升高最為顯著，明顯高于同期假手術(shù)組、去勢組及模型A、B組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。研究結(jié)果表明家兔通過耳緣靜脈注射IS，增加鐵的攝入，可誘導(dǎo)家兔絕經(jīng)后SF水平的升高，這也證明了本研究方法能成功誘導(dǎo)家兔絕經(jīng)后鐵蓄積模型的建立。

更年期是女性生殖能力結(jié)束的時期，一般發(fā)生在45～54歲，處于此年齡段的女性卵巢活動減少，雌激素停止生產(chǎn)。體內(nèi)雌激素以雌酮、17β-E2、雌三醇三種形式存在，其中E2活性最強，雌酮和

E2可以在血中互相轉(zhuǎn)化，維持動態(tài)平衡。其中雌三醇是雌酮和E2的代謝產(chǎn)物，生物活性非常弱，

E2是反應(yīng)雌激素水平的主要指標之一。無論是何種生物，在生理狀態(tài)下都缺少排泄鐵的機制，而正常女性一年經(jīng)過月經(jīng)宮血可排出大約36 mg鐵，絕經(jīng)后女性由于失去了上述鐵排泄途徑，容易造成鐵在體內(nèi)的積累，因此鐵蓄積在絕經(jīng)后女性中多見。一項臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)：雌激素缺乏與鐵蓄積密切相關(guān)，當(dāng)雌激素較正常水平降低90%時，絕經(jīng)后SF水平可較絕經(jīng)前增加2～3倍[17-18]。該研究表明，隨著圍絕經(jīng)期雌激素的逐漸衰退，出現(xiàn)了停經(jīng)，鐵開始在體內(nèi)積累，鐵蓄積程度隨著雌激素的減少而逐漸加重。但由于鐵穩(wěn)態(tài)主要接受鐵調(diào)素（hepcidin）的調(diào)節(jié)[19]，而雌激素可抑制hepcidin的表達，當(dāng)缺乏雌激素時，機體hepcidin的表達水平升高，可抑制機體對鐵的吸收，進而維持鐵穩(wěn)態(tài)[20-21]，當(dāng)hepcidin表達過高時，甚至還會出現(xiàn)缺鐵的情況[22]。本實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)：造模后第8周，去勢組17β-E2水平低于假手術(shù)組（P<0.05），但兩組SF水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；且去勢組造模后第

8周的SF與E2水平無相關(guān)性（P>0.05）。上述結(jié)果提示，雌激素的下降并不能引起鐵含量的增加，絕經(jīng)后鐵含量與雌激素之間無相關(guān)性。因此，本研究初步推測：女性雌激素缺乏并不是引起鐵蓄積的直接原因，可能與絕經(jīng)后停止宮血排鐵有關(guān)，鐵蓄積的形成可能主要與機體鐵排泄途徑的減少及攝入增多有關(guān)，目前仍需進一步研究證實。

綜上所述，因雌激素缺乏并不是引起鐵蓄積形成的原因，且雌激素缺乏可促進hepcidin的表達，抑制對鐵的吸收，故僅通過去勢法減少鐵的排泄途徑不利于短期內(nèi)建立動物鐵蓄積模型。本實驗通過去勢法結(jié)合注射過量IS，增加動物絕經(jīng)后鐵的攝入量，成功建立了家兔絕經(jīng)后鐵蓄積模型，且該模型的建立遵循絕經(jīng)后鐵蓄積的形成原理，能較好地模擬女性絕經(jīng)后鐵蓄積的發(fā)生發(fā)展，再加上家兔作為研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的優(yōu)勢，是比較適合廣泛應(yīng)用的絕經(jīng)后鐵蓄積動物模型。

參考文獻

[1]吳迪炯，葉寶東，羅赟飛，等.去鐵胺治療血液病輸血相關(guān)性鐵過載42例療效觀察[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（24）：4097-4099.

[2] Kim B J，Ahn S H，Bae S J，et al.Iron overload accelerates bone loss in healthy postmenopausal women and middle-aged men：a 3-year retrospective longitudinal study[J].J Bone Miner Res，2012，27（11）：2279-2290.

[3] Kharode Y P，Sharp M C，Bodine P V.Utility of the ovariectomized rat as a model for human osteoporosis in drug discovery[J].Methods Mol Biol，2008，455：111-124.

[4]張林林，姜習(xí)鳳，艾紅珍，等.絕經(jīng)后髖部脆性骨折中鐵過載指標與骨密度骨轉(zhuǎn)換指標關(guān)系的研究[J].中華外科雜志，2013，51（6）：518-521.

[5]郭魚波，馬如風(fēng)，王麗麗，等.骨質(zhì)疏松動物模型及其評價方法的研究進展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2015，21（9）：1149-1154.

[6]林華，徐又佳.重視絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折及鐵蓄積[J].中華骨科雜志，2015，35（10）：981-982.

[7]周鑫，陳付艷.Wnt信號通路在骨質(zhì)疏松中的研究進展[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（23）：3819-3821.

[8] Almeida M，Han L，Martin-Millan M，et al.Oxidative stress antagonizes Wnt signaling in osteoblast precursors by diverting beta-catenin from T cell factor- to forkhead box O-mediated transcription[J].J Biol Chem，2007，282（37）：27298-27305.

[9] Jia P，Xu Y J，Zhang Z L，et al.Ferric ion could facilitate osteoclast differentiation and bone resorption through the production of reactive oxygen species[J].J Orthop Res，2012，30（11）：1843-1852.

[10] Chen B，Li G F，Shen Y，et al.Reducing iron accumulation：A potential approach for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis[J].Exp Ther Med，2015，10（1）：7-11.

[11] Chon S J，Choi Y R，Roh Y H，et al.Association between levels of serum ferritin and bone mineral density in Korean premenopausal and postmenopausal women：KNHANES 2008-2010[J].PLoS One，2014，9（12）：e114972.

[12] Li J，Hou Y，Zhang S，et al.Excess iron undermined bone load-bearing capacity through tumor necrosis factor-alpha-dependent osteoclastic activation in mice[J].Biomed Rep，2013，1（1）：85-88.

[13] Liu G，Men P，Kenner G H，et al.Age-associated iron accumulation in bone：implications for postmenopausal osteoporosis and a new target for prevention and treatment by chelation[J].Biometals，2006，19（3）：245-251.

[14]劉祿林，高超，王嘯，等.鐵過載對去勢大鼠骨代謝的影響[J].中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志，2013，6（4）：314-319.

[15]王嘯，劉祿林，趙國陽，等.鐵蓄積小鼠去勢前后骨吸收活性的差異[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2015，21（1）：53-58.

[16] Vu'o'ng Lê B，Khorsi-Cauet H，Villegier A S，et al.New rat models of iron sucrose-induced iron overload[J].Exp Biol Med（Maywood），2011，236（7）：790-799.

[17] Reagan-Shaw S，Nihal M，Ahmad N.Dose translation from animal to human studies revisited[J].Faseb J，2008，22（3）：659-661.

[18] Huang X，Xu Y，Partridge N C.Dancing with sex hormones，could iron contribute to the gender difference in osteoporosis？[J].Bone，2013，55（2）：458-460.

[19] Jeli? M，Cvetkovi? T，Djordjevi? V，et al.Hepcidin and iron metabolism disorders in patients with chronic kidney disease[J].Vojnosanit Pregl，2013，70（4）：368-373.

[20] Ganz T，Nemeth E.Hepcidin and disorders of iron metabolism[J].Annu Rev Med，2011，62：347-360.

[21] Yang Q，Jian J，Katz S，et al.17 beta-Estradiol inhibits iron hormone hepcidin through an estrogen responsive element half-site[J].Endocrinology，2012，153（7）：3170-3178.

[22] Raso G M，Irace C，Esposito E，et al.Ovariectomy and estrogen treatment modulate iron metabolism in rat adipose tissue[J].Biochem Pharmacol，2009，78（8）：1001-1007.

（收稿日期：2018-05-21） （本文編輯：董悅）