基于1H NMR方法的傳統(tǒng)發(fā)酵主食小分子代謝物組分析

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(1.北京市理化分析測試中心，北京市基因測序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心，北京 100094；2.北京旗艦食品集團有限公司，北京 100194)

在我國運用傳統(tǒng)發(fā)酵劑(又名：老酵頭、酵子、老面、面引子)[1]發(fā)酵蒸制饅頭，具有一千多年歷史。隨著時代變遷和社會科學(xué)不斷進步，人們對蒸制饅頭的關(guān)鍵物質(zhì)傳統(tǒng)發(fā)酵劑的關(guān)注研究從未間斷。運用傳統(tǒng)方法蒸制的饅頭是老祖宗留給后人的“舌尖上的美味”，是北方的傳統(tǒng)美食。數(shù)據(jù)顯示，每年我國40%的小麥及進口小麥用于饅頭生產(chǎn)[2]。商品化的饅頭因為引入自動化生產(chǎn)線，并且使用單一酵母發(fā)酵劑，產(chǎn)品質(zhì)量相對穩(wěn)定，生產(chǎn)規(guī)模較大，但風(fēng)味較為單一；家庭式手工方法生產(chǎn)的饅頭因為使用傳統(tǒng)發(fā)酵劑，更多的保留了傳統(tǒng)特色風(fēng)味，并且隨著發(fā)酵劑種類的不同風(fēng)味也發(fā)生變化[3]。發(fā)酵劑中微生物菌群多樣性構(gòu)成不同，發(fā)酵饅頭中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同[4]。本實驗研究中，采用重水磷酸鹽緩沖液浸提饅頭樣品中的小分子代謝產(chǎn)物，并采用一維氫譜核磁共振技術(shù)方法定性及定量分析其成分構(gòu)成及含量，為進一步明確傳統(tǒng)老酵饅頭與干酵母饅頭的異同，從而為老酵中微生物代謝組學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

面粉(北京糧海食品有限公司)；傳統(tǒng)老酵母QJ(北京旗艦食品有限公司)；傳統(tǒng)老酵母ZZ(天津居民自制)；燕山牌高活性干酵母YS(河北馬利食品有限公司，批號20150704)；高活性干酵母AQ(安琪酵母(赤峰)有限公司，批號20120904)。

1.1.2 實驗儀器

CPA225D十萬分之一天平(日本賽多利斯公司)；Centrifuge 5417R高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)；低溫真空冷凍儀；渦旋振蕩器(美國SCIENTIFIC INDUSTRIES公司)；核磁管；DRX-400型核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)。

1.1.3 試劑

重水磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pD 7.0)，加入10%重水(5 mL)于50 mL 容量瓶中，加入0.5 mmol/L內(nèi)標(biāo)TSP(0.00431 g)，5 mmol/L 咪唑(0.017019 g)，加超純水定容至 50 mL)。

0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀0.68g，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液29.1mL，用水稀釋至100mL。

1.2 方法

1.2.1 饅頭樣品制作方法

老酵饅頭及酵母饅頭做法參照文獻方法。

1.2.21H NMR樣品前處理

將儲存在-20℃的饅頭樣品放置在4℃預(yù)解凍3h。將饅頭掰成小塊平放在9mm培養(yǎng)皿中，置于-20℃預(yù)冷凍12h，置于真空冷凍干燥儀中-45℃，0.00001 mPa(10～20 Pa)主冷凍干燥18～-24 h。

1.2.31H NMR樣品處理[5]

準(zhǔn)確稱取100 mg樣品，粉末后置于 2.0 mL離心管中，在冰上加入 1.5 mL已冷卻的超純水，渦旋振蕩60 s之后置于冰上10 min，然后在4℃下以13000 rpm的轉(zhuǎn)速離心10 min。取1.0 mL上清液于新的離心管中，等體積加入重水磷酸鹽緩沖液，在4℃下以13000 rpm的轉(zhuǎn)速離心10 min。取1000μL上清液轉(zhuǎn)移新離心管中，-80℃保存。取500 μL上清液轉(zhuǎn)移到5 mm內(nèi)徑的核磁管中進行測定。每個樣品4個平行，為了保證數(shù)據(jù)重復(fù)性，4個平行來自同一個處理。

1.2.41H NMR樣品檢測

采用 Avance III型氫質(zhì)子共振頻率 600.13 MHz 核磁共振譜儀(Bruker，德國)、5 mm PATXI探頭于300 K進行檢測。一維液體1H NMR測試的參數(shù)設(shè)置如下：掃描次數(shù)為64次，脈沖序列為noesyprld，弛豫延遲為4 s，混合時間為1 s，收集時間為 2.28 s，虛擬掃描的穩(wěn)態(tài)瞬變次數(shù)為4次，梯度脈沖時間為1 ms，預(yù)飽和方式壓制水峰，譜寬為7184 Hz，數(shù)據(jù)點數(shù)為32 K。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析[6]

1H NMR 的原始數(shù)據(jù)由儀器自帶的 XWINNMR(Version 3.5，Bruker)軟件充零，設(shè)定指數(shù)線寬因子為0.3 Hz，然后進行傅立葉轉(zhuǎn)換、相位調(diào)整、基線校正和零位移標(biāo)定。利用 Chenomx NMR suite professional(version 7.0，Chenomx Inc.，Canada)軟件進行譜峰的確定及化合物定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 4種發(fā)酵饅頭1H NMR檢測成分

采用傳統(tǒng)老酵頭作為發(fā)酵劑制作的2 種饅頭QJ、ZZ，與市售活性酵母發(fā)酵劑制作的2 種饅頭AQ、YS在相同的取樣條件和分析條件下進行比較，1H NMR分離鑒定各饅頭樣品中主要代謝物的種類及含量分別見表1，1H NMR圖譜見圖1。

由圖1可知，在一些區(qū)域中，四種發(fā)酵劑發(fā)酵制作的饅頭樣本中的代謝產(chǎn)物的種類和含量存在著一定的差異，說明4中發(fā)酵劑制作的饅頭其小分子代謝物成分各有特點。在原材料相同，發(fā)酵制作工藝類似的前提下，這種差異和特點可能是由發(fā)酵菌劑的不同導(dǎo)致的。

表1 4種饅頭樣品中1H NMR代謝物分析結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

圖1 4種饅頭1H NMR圖譜直觀比較

由表1得出，從QJ樣品中鑒定出29種小分子代謝物，總濃度為16.8 nmol/L，包括糖類8種(7.8 nmol/L)，酸類15種(5.7 nmol/L)，醇類4種(2.5 nmol/L)，酯類2種(0.9 nmol/L)，不含其他類；從AQ樣品中鑒定出38種小分子代謝物，總濃度為17.9 nmol/L，包括糖類10種(8.5 nmol/L)，酸類19種(3.6 nmol/L)，醇類5種(3.2 nmol/L)，酯類2種(2.0 nmol/L)，其他類2種(0.6nmol/L)；從ZZ樣品種鑒定出33種小分子代謝物，總濃度為17.7 nmol/L，包括糖類9種(8.5 nmol/L)，酸類16種(3.1 nmol/L)，醇類4種(3.1 nmol/L)，酯類2種(2.4 nmol/L)，其他類2種(0.5 nmol/L)；從YS樣品中鑒定出35種小分子代謝物，總濃度為18.9 nmol/L，包括糖類10種(9.9 nmol/L)，酸類16種(2.8 nmol/L)，醇類5種(3.3 nmol/L)，酯類2種(2.6 nmol/L)，其他類2種(0.4 nmol/L)。

2.2 4種饅頭中代謝產(chǎn)物的比較(圖2)

上述4種發(fā)酵劑制作饅頭樣品中小分子代謝物的比較結(jié)果顯示，主要的代謝物有糖類、酸類、醇類、酯類和其他類等。饅頭制作的主要原料面粉中的淀粉水解產(chǎn)生糖類化合物，淀粉或糖經(jīng)發(fā)酵劑中微生物的代謝作用產(chǎn)生醇類化合物，高級醇氧化或氨基酸降解或醛醇縮合反應(yīng)產(chǎn)生酯類化合物[7]。4種饅頭樣本中糖類的含量最高，這主要是因為淀粉水解直接產(chǎn)生或面粉中本身含有大量糖類物質(zhì)，而且糖類物質(zhì)多為非揮發(fā)性物質(zhì)，在饅頭蒸制過程中留在饅頭中，在核磁檢測的前處理中浸提出來并被大量檢測到，含量分別占到各種樣本總含量的46.2%(QJ)、47.6%(AQ)、48.3%(ZZ)、52.1%(YS)。甘露糖是本次檢測結(jié)果中除麥芽糖、葡萄糖外含量相對較高的一種單糖，甘露糖以游離狀態(tài)存在于某些植物果皮中，如柑橘皮中，桃、蘋果等水果中有少量游離的甘露糖。其他QJ(1.9 nmol/L)含量最高，遠(yuǎn)高于其他3種饅頭，ZZ中沒有檢出。

圖2 QJ與AQ饅頭1H NMR圖譜主成分比對分析(PC1)

醇類物質(zhì)是僅次于糖類與酸類物質(zhì)的代謝物?？偤砍^2 nmol/L，其中阿拉伯糖醇的含量最高，分別達(dá)到1.5 nmol/L(QJ)、2.0 nmol/L (AQ)、2.2 nmol/L(ZZ)、2.0 nmol/L(YS)，自然界中存在的D-阿拉伯糖醇含量很少，生產(chǎn)中以活的微生物(耐滲酵母等)為細(xì)胞工廠，多種酶促反應(yīng)生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，饅頭中阿拉伯糖醇高的原因可能與發(fā)酵劑中微生物(酵母)發(fā)酵有關(guān)[9]。乙醇含量較高(4種樣品中均約1 nmol/L)，雖然乙醇具有揮發(fā)性，但仍有部分留在饅頭中被檢測到。

如圖2，為區(qū)分QJ和AQ兩種饅頭貢獻較大的主要代謝化合物包括2-甲基戊二酸、丙氨酸、半胱氨酸、麥芽糖、阿拉伯糖、果糖、葡糖醛酸、磷酸甘油酸、延胡索酸；丙二醇、羥基丁酸、乳糖、醋酸、順烏頭酸、硫胱氨酸、葡萄糖、精氨酸、羥基丁酸和甘露糖。

3 結(jié)論

本實驗使用4種不同的發(fā)酵劑，使用同一批次面粉蒸制饅頭，利用1H NMR分析方法對4種饅頭樣品中的小分子代謝產(chǎn)物進行分析，并按照化合物特征分類，由此對不同發(fā)酵劑產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物差異進行比較分析。

利用1H NMR的分析方法從饅頭樣品中一共鑒定出41種化合物，其中QJ樣品中為29種，AQ樣品中為38種，ZZ樣品中為33種，YS樣品中為35種。從代謝物種類上分析，4種發(fā)酵劑的主要產(chǎn)物可分為糖類、酸類、醇類、酯類、其他類，其他類在QJ樣品中未檢測到；從成分的含量上分析，4種發(fā)酵劑制作饅頭樣品呈現(xiàn)出各自的特色，如QJ中甘露糖(1.9 nmol/L)、乳酸鹽(1.5 nmol/L)、硫胱氨酸(0.4 nmol/L)含量較高，AQ中核糖(1.9 nmol/L)、脫氧腺苷(0.6 nmol/L)含量較高，ZZ中葡萄糖(1.6 nmol/L)、尿苷二磷酸半乳糖(0.12 nmol/L)含量較高，YS中乙醇(1.2 nmol/L)、葡糖醛酸酯(2.6 nmol/L)含量較高。結(jié)果說明發(fā)酵劑的種類不同，即發(fā)酵劑中微生物多樣性菌種的種類與組成，對饅頭中代謝產(chǎn)物起重要作用。

核磁共振技術(shù)在代謝組學(xué)中的應(yīng)用還存在一些局限性，主要是其靈敏度較低，可能會導(dǎo)致一些濃度較低但發(fā)揮很大作用的化合物無法檢測或檢測不準(zhǔn)確等問題[10]。核磁共振檢測的結(jié)果與氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測結(jié)果有著較強的互補性，后者主要側(cè)重?fù)]發(fā)性代謝產(chǎn)物的分析，而前者主要針對非揮發(fā)性的小分子代謝產(chǎn)物進行分析，兩種檢測結(jié)果的結(jié)合可以為提供較為全面的代謝物指紋分析。