心肌線粒體蛋白質(zhì)組學中的雙向電泳及硝酸銀染色方法的優(yōu)化

魏義勇，李 科，劉 云，曹 嵩，王海英*

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 麻醉科， 貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院 麻醉科， 貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學院 醫(yī)學與生物學研究中心， 貴州 遵義 563099)

線粒體是心肌氧化應激和鈣超載損傷的重要場所，是調(diào)控缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IR)的重要細胞器[1-2]。利用心肌線粒體蛋白質(zhì)組學找尋相關靶蛋白，再以這些靶蛋白為切入點進行研究，有助于進一步揭示IR的機制。然而，蛋白質(zhì)組學中用到的雙向電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)技術(shù)復雜，對實驗要求高。鑒于此，本研究通過反復實踐，將2-DE技術(shù)及硝酸銀染色方法進行優(yōu)化，用于大鼠心肌線粒體蛋白質(zhì)組學研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 制備樣本：SPF級SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g[陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK(渝)2007-0005]。麻醉后取心室肌組織，剪碎，勻漿。按照本實驗室前期方法制備提純線粒體[3]。

1.1.2 主要試劑配：2-DE試劑： 水化上樣緩沖液、膠條平衡緩沖液母液、膠條平衡緩沖液Ⅰ(膠條平衡緩沖母液4 mL，DTT 0.08 g)、膠條平衡緩沖液Ⅱ(膠條平衡緩沖母液4 mL，碘乙酰胺0.125 g)，以上試劑及配方(均來自Bio-rad公司)。

硝酸銀染色試劑：固定液(無水乙醇100 mL、冰乙酸25 mL及MilliQ水125 mL)、敏化液(Na2S2O3·5H2O 0.157 g，MilliQ水500 mL)、銀染液(硝酸銀0.5 g、甲醛0.05 mL及MilliQ水250 mL，避光保存)、顯影液(Na2S2O3·5H2O 0.003 9 g、Na2C2O315 g、甲醛 0.25 mL及MilliQ水定容至500 mL)、定影液(甘氨酸1.25 g，MilliQ水250 mL)(均購自成都科龍化工試劑公司)。

1.2 方法

1.2.1 雙向電泳：向提純的線粒體中加入水化上樣緩沖液，裂解超聲后12 000×g，離心15 min，即得到線粒體蛋白。按RCDC試劑盒說明行蛋白定量。選擇pH5～8，24 cm IPG膠條，上樣量300 μg，體積350 μL。優(yōu)化Bio-rad公司提供的等電聚焦程序行第一向等電聚焦(IEF)，主要體現(xiàn)在主動水化時間延長為20 h(Bio-rad指南為16 h)，較Bio-rad指南延長除鹽時間2 h，適當降低了線性升壓的時間和電壓，聚焦電壓從60 000 V升高到80 000 V。IEF后的IPG膠條加入膠條平衡緩沖液Ⅰ，慢搖13 min。加入膠條平衡緩沖液Ⅱ，慢搖13 min(Bio-rad操作指南為慢搖20 min)。配置SDS-PAGE凝膠行第二向凝膠電泳。

1.2.2 硝酸銀染色及掃描：將固定液加入放有凝膠的盤中，慢搖2 h；加入敏化液，敏化1 min；加入染色液，慢搖30 min；加入顯影液，立即手工搖動，控制顯影時間；加入定影液固定凝膠背景。每個步驟完成均用MilliQ純水快速漂洗2遍，每次約12 s。優(yōu)化主要體現(xiàn)在縮短漂洗的時間，配置試劑作了適當調(diào)整，例如未使用戊二醛、減少甲醛用量、及使用冰乙酸等。通過EPSON掃描儀進行掃描，觀察圖像的顏色，背景。PDQuest2D 8.0軟件分析蛋白質(zhì)斑點數(shù)。

2 結(jié)果

優(yōu)化第一向等電聚焦前后的圖像(圖1A，B)。優(yōu)化硝酸銀染色前后的圖像(圖1C，D)。可見，經(jīng)優(yōu)化2-DE的各個環(huán)節(jié)及硝酸銀染色經(jīng)優(yōu)化后，凝膠圖像更清晰，蛋白質(zhì)斑點明顯增多。 優(yōu)化2-DE凝膠掃描圖像的蛋白質(zhì)斑點數(shù)427±23，顯著高于Bio-rad公司提供的2-DE凝膠掃描圖像的蛋白斑點數(shù)325±15(P<0.05)。優(yōu)化硝酸銀染色法凝膠掃描檢測到的蛋白質(zhì)斑點數(shù)438±23，顯著高于經(jīng)典硝酸銀染色法凝膠掃描后的蛋白質(zhì)斑點數(shù)305±12(P<0.05)。

3 討論

本實驗優(yōu)化2-DE技術(shù)的各個環(huán)節(jié)， 第一向等電聚焦過程中對聚焦程序進行了優(yōu)化，使得更多的微量蛋白質(zhì)進入IPG膠條。減少膠條平衡的時間，避免了部分蛋白質(zhì)在膠條平衡過程中丟失。優(yōu)化硝酸銀染色方法，使得更多的蛋白質(zhì)斑點顯影，且凝膠背景更清晰。

圖1 2-DE及硝酸銀染色的凝膠圖像Fig 1 Image of 2-DE and silver nitrate staining

本實驗室前期做了大量的預實驗，最終制定本方案，并應用于后續(xù)課題研究[4]。經(jīng)軟件分析圖像，找到的差異蛋白經(jīng)質(zhì)譜全部鑒定，且均為線粒體蛋白。因此，表明本實驗優(yōu)化的2-DE技術(shù)能夠較好的應用于線粒體蛋白組學的研究，對其他組織的蛋白組學研究有參考價值。